Clonaje de fragmento b1-ar en pbluescript

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL II

CUADERNO DE PRÁCTICAS

Parte I.- Genética Molecular













Alumno/a: Paulina Salinas Alvarado
Grupo: 2267
Profesor/a: Miguel Ángel Iñiguez Peña
2º curso Grado en Bioquímica
Curso 2011-2012
Dpto. de Biología Molecular
Facultad de Ciencias, UAM
DÍA 1. OBTENCIÓN DE DNA GENÓMICO DE UNA LÍNEA CELULAR HUMANA. REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN (PCR)AISLAMIENTO DE DNA GENÓMICO DE LÍNEAS CELULARES

1. Datos de espectrofotometría (nanodrop)

|Muestra |ng/(l |A260 |A280 |A260/A280 |A260/A230 |
|DNA genómico |22.2 |0.443 |0.253 |1.75 |0.85 |

1.2. Cálculos de concentración (1unidad de D.O. (A260) de dsDNA = 50 µg /ml) y discusión de los valores de relación de absorbancias 260/280 y 260/230 obtenidos para vuestra muestra de DNA genómico.

Si 1 unidad de D.O. (A260) de dsDNA = 50 µg /ml;

0.443 unidades de D.O. (A260) de dsDNA = 50 µg /ml x 0.443 = 22.15 µg /ml = 22.15 ng/(l [pic]22.2 ng/(l

Lo que confirma la concentración proporcionada por el nanodrop

1.3.Cálculos de cantidad de DNA genómico por célula (106 células por preparación de DNA)

Sabemos que la concentración de DNA genómico que tenemos es de 22.2 ng/(l en un volumen de aproximadamente 200 (l, el volumen de Elution buffer que utilizamos para liberar el DNA del sílice utilizado en el proceso de purificación (cromatografía de adsorción). Por lo tanto:

Cantidad de DNA genómico = 22.15 ng/(lx 200 (l = 4430 ng de DNA genómico.

Y si teníamos 106 células por preparación de DNA tendremos:

4430 ng de DNA genómico /106 células = 4.43 x 10-3 ng de DNA genómico por célula.

1.4. En el caso de usar sangre como fuente para la extracción de DNA genómico como molde en una reacción de PCR se recomienda el uso de EDTA como anticoagulante en vez de heparina. ¿Por qué razón? ¿Quérelación tiene con el Inhibitor removal agent presente en el kit de extracción de DNA?

En el caso de usar sangre como fuente para la extracción de DNA genómico como molde en una reacción de PCR se recomienda el uso de EDTA como anticoagulante en vez de heparina, porque este además de ser un potente anticoagulante, nos inactiva através de la formación de quelantes iones metálicos como el calcio omagnesio, inhibidores de la reacción de PCR al ser cofactores necesarios para actividad de las endonucleasas, evitando por tanto su acción y protegiendo el DNA.

Por otro lado mientras que el EDTA centra su función anticoagulante en la inactivación del ión calcio, componente de la cascada de coagulación, además de inactivar otros iones que pueden inhibir la reacción de PCR, la heparina, cofactor de laantitrombina III, actúa como anticoagulante mediante la inhibición de la trombina, otro componente de la cascada de coagulación que no interviene en la reacción de PCR, por lo que es mucho más práctica la utilización de EDTA.
También hay que tener en cuenta que no es recomendable usar el EDTA en grandes concentraciones, ya que en la reacción de PCR es necesaria la presencia de iones magnesiopara la actividad de la polimerasa, por lo que generalmente antes de la misma, utilizamos el Inhibitor removal agent, una solución presente en el kit de extracción de DNA cuya función es eliminar los inhibidores de la reacción de PCR, como pude llegar a ser el caso del EDTA.

1.5. Comentarios o incidencias en el desarrollo de la práctica

Cabe destacar que la concentración de dsDNA que hemosobtenido es bastante baja, con respecto a lo que cabe esperar, además de que presenta signos de contaminación con otros productos celulares, según nos indica el pico en A230 que hace que la relación de A260/230 sea bastante baja, 0.85, mientras que la relación óptima sería entorno a dos. Lo que nos indica un grado muy alto de contaminación con sustancias que absorben a 230 nm, como el EDTA,...