Clonaje De Plásmidos

CLONAJE DE GENES EN PLÁSMIDOS BACTERIANOS: Construcción del DNA recombinante

Introducción
Los plásmidos bacterianos son moléculas de DNA extracromosómico capaces de replicar autónomamente. La mayoría están constituidos por un DNA bicatenario circular cerrado de tamaño muy variable (1 a >200 kb), que se puede aislar de la bacteria en forma superenrollada. Se encuentran en una gran variedad deespecies bacterianas, pero suelen tener un rango de huésped estrecho. La replicación y transcripción de los plásmidos dependen, en mayor o menor extensión, de proteínas codificadas por genes de la bacteria. A su vez, los plásmidos contienen con frecuencia genes que codifican enzimas útiles para la bacteria huésped como genes de resistencia a o producción de antibióticos, de degradación decompuestos orgánicos, de toxinas, y de producción de enzimas de restricción y modificación, entre otros.

Los plásmidos pueden utilizarse como vectores de clonaje y amplificación de fragmentos de DNA que se hayan insertado en los mismos mediante técnicas de Ingeniería Genética. Estos fragmentos replican y se transmiten a las células hijas conjuntamente con el resto del plásmido. Los primeros plásmidosusados como vectores eran de origen natural, pero en la actualidad se usan plásmidos modificados en los que se han introducido características útiles para el clonaje, a expensas de eliminar muchas secuencias innecesarias del plásmido original. Por ejemplo:
1. Marcadores de selección. Generalmente genes de resistencia a antibióticos como ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc.
2. Un sitio depoliclonaje que es una secuencia sintética que contiene las secuencias reconocidas por varias enzimas de restricción.
3. Este sitio de policlonaje puede estar insertado dentro de un gen marcador lo que permite la selección directa de los recombinates. Por ejemplo, existen plásmidos en los que el sitio de policlonaje se encuentra dentro de una secuencia de DNA que codifica un fragmento ()N-terminal de la -galactosidasa. El fragmento  inactivo puede complementar con otro fragmento, también inactivo, de la -galactosidasa codificado en ciertas bacterias huésped, originando -galactosidasa activa. Cuando se inserta el DNA foráneo en el vector se inactiva el fragmento , de forma que las bacterias que contienen el plásmido recombinante no expresan -galactosidasa. Existen métodos sencillosque permiten identificar bacterias en base a la presencia o no de -galactosidasa en las mismas.
4. El origen de replicación del plásmido ColE1, para conseguir un número de copias elevado del plásmido, y otro origen de replicación derivado de un fago con DNA monocatenario (M13, f1), que permite producir fagos filamentosos con copias monocatenarias del DNA clonado, útiles para secuenciación,mutagénesis, etc.
5. Promotores de fagos (T7, SP6) delante del sitio de policlonaje. Útiles para la transcripción/traducción in vitro del DNA clonado, o para su expresión regulada in vivo si el plámido recombinante se introduce en bacterias que expresan la RNA polimerasa viral.
6. En los vectores de expresión, se suelen introducir además de promotores regulables, para expresar el gen clonado enrespuesta a cambios en las condiciones de cultivo, la secuencia Shine-Dalgarno, que confiere alta eficiencia de traducción, y una secuencia de nucleótidos que codifica un pequeño polipéptido (una “etiqueta”) que puede ser reconocido por anticuerpos específicos. El gen clonado y la etiqueta se expresan conjuntamente originando una proteína de fusión, fácilmente detectable con los anticuerpos. Tambiénexisten “etiquetas” que permiten la purificación rápida de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad.

Las enzimas de restricción del tipo II constituyen la herramienta enzimática esencial para la construcción de DNAs recombinantes. Se trata de endonucleasas que reconocen secuencias cortas y específicas en el DNA, cortándolo por dicha región siempre que determinadas bases de la...