Clonaje de un Enzima

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID

Clonaje De Un Enzima
Modificación del enzima D-phenylglicine
aminotransferase

20/04/2014

Este trabajo consiste en la modificación del enzima D-phenylglicine aminotransferase para una
mayor obtención del aminoácido Ácido L-glútamico.

1.- ESQUEMA DE LA RUTA METABÓLICA

2.- DEFINICIÓN DEL ENZIMA
El enzima que vamos a utilizar es la D-phenylglycineaminotransferase (D-PhgAT),
extraído de Pseudomonas stutzeri. Este es un homodímero donde cada monómero posee
tres dominios, C-terminal, N-terminal y un dominio de unión del cofactor con 453
residuos de aminoácidos y 47.5 kDa de peso molecular. Como cofactor, necesita
piridoxal fosfato (PLP), es un derivado de la piridoxina o vitamina B6. Su localización
dentro del organismo es en elcitoplasma.
La enzima cataliza una transaminación reversible específica para D-fenilglicina o D-4hidroxifenilglicina, en la que el 2-oxoglutarato es el aceptor del grupo amino, que se
convierte en el ácido L-glutámico.
Tiene la interesante propiedad de invertir la estereoespecificidad. Se puede utilizar ácido
oxaloacético, un aceptor amino y D-fenilglicina o D-p-hidroxifenilglicina como donante
amino apartir de ácido L-glutámico y benzoilformato o p-hidroxi-benzoilformiato,
respectivamente. La reacción es reversible y utiliza L-glutamato como donante del
grupo amino para formas D-fenilglicina o D-p-hidroxifenilglicina en un solo paso, sin
requerir una enzima racemasa.
Debido a su característica de invertir la esteroespecificidad, en la actividad de
transaminación se puede utilizarL-glutamato, que es un donante del grupo amino más
barato, para la síntesis enantiomérica enzimática de D-fenilglicina o D-4hidrocifenilglicina en una sola etapa de reacción de transaminación, sin la necesidad de
cualquier racemasa que isomerice aminoácidos, L-aminoácido, como ocurre con las
aminotransferasas D-aminoacidícas típicas, que aceptan solo como sustrato Daminoácido.
3.- UTILIDAD DELPRODUCTO
La D-PhgAT, es un enzima con un alto potencial en la biotecnología y en el sector
farmacéutico. El producto D-fenilglicina o D-p-hidroxifenilglicina, se utiliza para hacer
ampicilina y amoxicilina respectivamente. El proceso puede ser importante para la
utilización del ácido fenilacético, subproducto obtenido a partir del proceso de
conversión de penicilina-G a ácido 6-aminopenicilánicopor la enzima penicilina
acilasa.

4.- PROCEDIMIENTO DE PCR
4.1.- Organismo de proveniencia
Como ya se indico anteriormente, la enzima D-PhgAT proviene de la bacteria
Pseudomonas stutzeri. Es una bacteria Gram negativa que procede del suelo.
4.2.- Secuencia codificante de ADN y traducción a proteína
En la secuencia de ADN tenemos en la posición 301 el inicio de la secuencia de nuestraproteína D-PhgAT y en la posición 1662 aparece nuestro triplete STOP. Por lo tanto, la
secuencia que aparece marcada en color es la secuencia de nuestra enzima D-PhgAT.
1 CTGCAGGCCC AGCTCCGCTT CTAGCAGGGC GATCTGACGG CTTACCACGG AAGGCGCAAT
61 GTCGAGGGCG TCACCTGCGG CACGCATGGA GCCATGACGC AGCACAGCGG CCAGATAGTT
121 GAGACGCTGA AAACCTGGAT AGAGATCTTT CATCTGCTGC TCATTCGTTG ACTAAAAAGC
181 AACGATAAGA TACCCAGAACCTCGTTGTTC TAGCAATCTT TCAACAGTAA TCTCGACTTC
241 AAGGGGCACT AGCCCCCCAC CCATCCCCAC CTACCAACTA CAATCAGTAG GGGCATCGGT
301 ATGTCGATCC TTAACGACTA CAAACGTAAG ACAGAAGGCT CAGTATTTTG GGCACAACGC
361 GCTCGGTCGG TCATGCCCGA CGGCGTAACC GCAGACACCC GAGTATTTGA CCCACACGGC
421 CTTTTCATTA GTGACGCCCA AGGCGTTCAC AAGACCGATG TAGACGGCAA TGTGTACCTA
481 GACTTTTTTG GCGGGCACGG AGCCCTCGTA CTAGGTCATG GCCATCCTCG GGTTAACGCA541 GCCATCGCCG AAGCTCTTAG CCATGGCGTC CAGTACGCGG CCAGCCACCC ACTGGAAGTG
601 CGATGGGCAG AACGCATCGT GGCCGCATTT CCCTCAATTC GTAAACTGCG CTTCACCGGA
661 AGCGGCACCG AAACTACGCT GCTGGCTTTG CGGGTAGCTC GTGCCTTCAC GGGCCGCCGC
721 ATGATACTGC GCATCGCCAC TCATTATCAT GGCTGGCACG ATTTTTCCGC ATCTGGTTAT
781 AACAGCCATT TCGATGGCCA GCCGGCGCCG GGCGTGCTAC CTGAAATTGC GAAGAATACT
841 TTGCTGATTC GCCCTGATGA TATTGAAGGC...