Clonamiento
Páginas: 4 (757 palabras)
Publicado: 6 de enero de 2013
Pasos básicos en la clonación de un fragmento de ADN
El ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la misma enzima de restricción.
Luego se ponen en contacto en presencia de unaligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el fragmento de interés (Modificado de Watson y col., 1992).
Vectores declonamiento:
Plásmido pBR322: es el primer plásmido utilizado en biotecnología, fue diseñado en 1977 por Bolívar y Rodríguez (de ahí su nombre pBR). A este plásmido se le han añadido dos genesmarcadores: un gen de resistencia a la ampicilina (ampr) y otro de resistencia a la tetraciclina (tetr); y tres dianas de restricción: EcoRI, PstI y BamHI. La inserción de ADN foráneo puede hacerse encualquiera de las tres secuencias.
El plásmido pBluescript es un vector comercializado de la serie pUC. Está formado por una molécula circular de ADN duplexo, de tamaño inferior a 3 kb, que comprende:1. Un fragmento lacZ + polylinker + 2 promotores: el fragmento del gen lacZ procede del operón lactosa de E. coli, y contiene el minigen de la β-galactosidasa (también contiene el promotor lac).En el extremo 5' terminal de este fragmento lacZ se ha introducido el polylinker. El polylinker es rico en sitios de restricción únicos, es importante que las dianas de restricción estén presentessólo una vez en el plásmido, pues si no, se fragmentaría la molécula, y lo que se pretende es linealizarla. Los promotores T3 y T7 también interrumpen el gen lacZ, se sitúan flanqueando el polylinker.Estas regiones promotoras proceden del fago T3 y T7 respectivamente, y son reconocidas por las enzimas ARN polimerasas de dichos fagos.
2. Un origen de replicación del fago M13 o F1: estosbacteriófagos son similares al fago ΦX174 de E. coli, su material genético es una molécula de ADN circular simplexo, pero cuando infecta a la bacteria se convierte en ADN circular duplexo, y por medio del...
El ADN a clonar y el vector (plásmido) se cortan con la misma enzima de restricción.
Luego se ponen en contacto en presencia de unaligasa para obtener una molécula de ADN recombinante que se introduce en bacterias que multiplicarán el plásmido junto con el fragmento de interés (Modificado de Watson y col., 1992).
Vectores declonamiento:
Plásmido pBR322: es el primer plásmido utilizado en biotecnología, fue diseñado en 1977 por Bolívar y Rodríguez (de ahí su nombre pBR). A este plásmido se le han añadido dos genesmarcadores: un gen de resistencia a la ampicilina (ampr) y otro de resistencia a la tetraciclina (tetr); y tres dianas de restricción: EcoRI, PstI y BamHI. La inserción de ADN foráneo puede hacerse encualquiera de las tres secuencias.
El plásmido pBluescript es un vector comercializado de la serie pUC. Está formado por una molécula circular de ADN duplexo, de tamaño inferior a 3 kb, que comprende:1. Un fragmento lacZ + polylinker + 2 promotores: el fragmento del gen lacZ procede del operón lactosa de E. coli, y contiene el minigen de la β-galactosidasa (también contiene el promotor lac).En el extremo 5' terminal de este fragmento lacZ se ha introducido el polylinker. El polylinker es rico en sitios de restricción únicos, es importante que las dianas de restricción estén presentessólo una vez en el plásmido, pues si no, se fragmentaría la molécula, y lo que se pretende es linealizarla. Los promotores T3 y T7 también interrumpen el gen lacZ, se sitúan flanqueando el polylinker.Estas regiones promotoras proceden del fago T3 y T7 respectivamente, y son reconocidas por las enzimas ARN polimerasas de dichos fagos.
2. Un origen de replicación del fago M13 o F1: estosbacteriófagos son similares al fago ΦX174 de E. coli, su material genético es una molécula de ADN circular simplexo, pero cuando infecta a la bacteria se convierte en ADN circular duplexo, y por medio del...
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