Colinesterasa

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y DE LA SALUD
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
LABORATORIO DE ANALISIS CLINICO

Profesor: Dra. Thayana Núñez
Alumno: Silvana Manzanares Loaiza
Fecha: Lunes, 09 de septiembre de 2013

COLINESTERASA
TOTAL E INHIBIDA

DETERMINACIÓN
Fundamento (Laboratorio Cromatest Linear Chemicals)

La colinesterasa (CHE) cataliza lahidrólisis del sustrato butiriltiocolina formando butirato y tiocolina. Esta última reduce el ácido 5,5´-mercaptobis-2-nitrobenzoico (DMNB) a 5-mercapto-2- nitrobenzoate (5-MNBA), un compuesto coloreado.
La reacción se controla cinéticamente a 405 nm a partir de la velocidad de formación del color amarillo producido, proporcional a la actividad CHE en la muestra



La inhibición por ladibucaina se efectua mediante un ensayo en paralelo en el que se halla presente la dibucaina en el substrato, evaluándose el porcentaje de inhibición por comparación con la actividad colinesterásica total presente en el substrato no tratado. El número de dibucaina resultante permite la clasificación e identificación de las variantes homo y heterozigóticas.
Reactivos:
COMPOSICION DELOSREACTIVOS
R1Tampón/Cromógeno. Tampón fosfatos 50 mmol/L pH 7,7, DMNB 0,25 mmol/L. Polvo.
R2 Sustrato. Yoduro de butiriltiocolina 7 mmol/L. Liofilizado.
R3 Dibucaina. Clorhidrato de dibucaina 2,6 mmol/L.
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Mantener los frascos cerrados, protegidos de la luz y evitar la contaminacióndurante su uso.
Descartar si se observan signos de deterioro:
Presencia de partículas y turbidez.
Los reactivos R1 y R2 si presentan una vez reconstituidos una absorbancia del Blanco (A) a 405 nm> 0,700 frente a aguadestilada en cubeta de 1 cm.

Preparación de los Reactivos
Reactivos de trabajo
1. Tampón/Cromógeno. Añadir 25 mL de agua destilada a un vial de R1. Tapar. Agitar.Reposar 15 min. antes de su empleo. Estable 6 semanas a 2-8ºC.
2. Sustrato. Añadir 2,0 mL de agua destilada a un vial de R2.

Mezclar. Estable 6 semanas a 2-8ºC. El sustrato en exceso puede congelarse una vez.

3. Reactivo inhibidor. Mezclar 9 volúmenes de Tampón/Cromógeno con 1 volumen de R3.
Muestra
Suero o plasma recogido con EDTA o heparina. Una hemólisis moderada no interfiere.
Lacolinesterasa en suero o plasma es estable varias semanas tanto a temperatura ambiente como refrigerada y durante 3 meses a –20ºC.
Técnica:
1. Preincubar los reactivos de trabajo y muestras a la temperatura de reacción (ver NOTAS).
2. Ajustar a 0 el fotómetro con agua destilada.
3. Pipetear en cubetas rotuladas:

Temperatura
25/
30oC

37oC
Tratamiento
Sin inhibidor
Con
inhibidor
Sininhibidor
Con
inhibidor
Tampón/Cromógeno
1.5 ml
--
1.5 ml
--
Reactivo Inhibidor
--
1.5 ml
--
1.5 ml
Muestra
10 ul
10 ul
--
--
Muestra dil. 1:2 con sol. Salina
--
--
10 ul
10 ul
Sustrato
50 ul
50 ul
50 ul
50 ul

4. Mezclar suavemente por inversión. Insertar la cubeta en el compartimiento termostatado del instrumento, poner el cronómetro en marcha y anotar laabsorbancia inicial.
5. Repetir las lecturas exactamente a los 30,60 y 90 segundos.
6. Calcular la diferencia entre absorbancias.
7. Calcular el promedio de los resultados para obtener el cambio promedio en absorbancia por segundo (∆A/30seg).
Cálculos:
U/L=∆A/ 1minx23111(37ºC) U/L=∆A/ 30segx46222(37ºC)
U/L=∆A/ 30segx23111(25/30ºC)

Muestras con ∆A superiores a 0,250 a 405nm deben diluirse 1:10consolución salina y repetir el ensayo. Multiplicar los resultados por 10.
Para expresar los resultados en unidades SI aplicar: U/Lx16,67=nkat/L

Colinesterasa inhibida

Para expresar el número de dibucaina aplicar:



Valores de Referencia

Colinesterasa total

Suero, plasma

Niños
Hombres y mujeres>(40años)
3,5-8,5 KU/L(58,3-141,7 µktal/L)
Mujeres,(16-39años) No embarazadas...