Colorcitometriafundamentos

Fundamentos y aplicaciones analíticas y separativas de la inmunofluorescencia y la citometría de flujo
Asignatura de Inmunología Universidad de Alcalá
Unidad mixta

CSIC/UAH

Jorge Monserrat Sanz

Objetivos
• 1. Entender la citometría de flujo como herramienta de estudio de la heterogeneidad celular en el campo del sistema inmune. • 2. Conocer los fundamentos de la citometría de flujo. •3. Conocer la aplicaciones tanto clínicas como en investigación que se realizan mediante la citometría de flujo. • 4. Puesta a punto, familiarización y conceptos prácticos de un citometro de flujo. • 5. Obtención de células mononucleares procedentes de sangre periférica. • 6. Realización de un staining directo(marcaje) de estas células mononucleares mediante el uso de anticuerpos monoclonalesespecíficos. Jorge Monserrat Sanz

Objetivos
• 7. Adquisición en un citometro de flujo. • 8. Estudio de la viabilidad mediante el uso de sondas intercalantes del ADN. • 9. Análisis de diferentes tipos de imágenes de citometría de flujo: Comprender las etapas en el proceso de la información obtenida por informació citometría citometrí • 10. Resolución de diferentes problemas clínicos reales. • 11.Estudio de los porcentajes, calculo de cifras absolutas e interpretación de intensidades medias de florescencia de células linfocitarias obtenidas de distintos casos patológicos reales. • 12. Interpretación de los resultados obtenidos. Jorge Monserrat Sanz

¿Qué debe ser el alumno al terminar el curso?
• Que después del curso el alumno sea:

1. Conocedor de los fundamentos y consciente delas aplicaciones de la citometría de flujo. 2. Eficiente preparando muestras para citometría y diseñando experimentos de citometría analítica y separativa. 3. Usuario competente y autosuficiente del citómetro de flujo analizador capaz de puesta a punto, adquisición y capaz de diagnosticar y solucionar situaciones problemáticas (compensación, flujo) 4. Analizador crítico conocedor de lasposibilidades de los software de análisis y exportación de datos.

Jorge Monserrat Sanz

Prácticas de Inmunología
• Primer día: Seminarios Interactivos (3 horas):
1. Fundamentos en Inmunofluorescencia y Citometría de flujo. 2. Aplicaciones de la citometría de flujo.

• Segundo y tercer día: 1. Dos actividades simultáneas (1.5 horas):
- Realización de una separación célular de células mononuclearesde sangre periférica. - Contaje de las células.

2. Citómetro de flujo: Fundamentos y utilización de un citómetro de flujo (1.5 horas). 3. Marcaje de superficie e intracelular de linfocitos de sangre periférica (1.5 horas): a. Marcaje de superficie. b. Viabilidad (7add). c. Anexina V. • Cuarto día (3 horas): – Análisis de imágenes de citometría de flujo. Problemas.

Jorge Monserrat SanzRelevancia
1. Estudio directo de las patologías mediante esta tecnología: Conocimiento y búsqueda de información de carácter pronóstico 2. Interpretación de vuestra fuente de lectura: la bibliografía de toda la comunidad científica biomédica

Jorge Monserrat Sanz

Evolución de la citometría multiparamétrica
25 NºColores 20

24 D 17 F

14 NºColores 12

6-12 F

10

Nº de Colores

1512 F 8F 4F 2-3 F Nace
1960 1970s 1980s 1997 2001 2002 2004 2006

Nº de Colores

8

11 F

10

6

4

2F

3F

4F

5

2

0

0 1989 1990s 1996 1997-98 2004-2005

Evolución Temporal EE.UU

Evolución Temporal Nuestro Laboratorio

Nº Artículos trabajando en Citom etría de Flujo
80000 70000 60000 NºArticulos

!!!más colores, más información!!! !!!Análisis cada vez máscomplicados!!!!!
Demanda: - Nuevas herramientas - Nuevas Estrategias de análisis

NºArtículos

50000 40000 30000 20000 10000 0

Jorge Monserrat Sanz

1960

1970s

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1997

2001

2002

2004

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Evolución tem poral

Heterogeneidad celular en el sistema inmune
T4 T8 CD45 CD2 CD3 CD56 CD4 CD45RA CD45RO CD8 CD45RA CD45RO CD45RA CD19 CD14 CD15 NK B Mono Neu

Jorge...