Colorimetria

27. Métodos para la cuantificación de proteínas
Emilio Fernández Reyes y Aurora Galván Cejudo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

En esta práctica se utilizaran tres métodos para la cuantificación de proteínas: Biuret, Bradford y BCA. Para cada uno de los métodos se realizaran: una curva estándar,el cálculo del coeficiente de extinción y el rango de sensibilidad. Se realizará la cuantificación de dos muestras problemas de baja y alta concentración, respectivamente, y se discutirá las ventajas e inconvenientes de cada uno de los métodos. Palabras clave: cuantificación de proteínas, Biuret, Bradford, BCA Abreviaturas: BCA: ácido bicinconínico

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1 Métodos parainconvenientes la cuantificación de proteínas: ventajas e

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Existendiferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes. En la Tabla I se recogen los métodos más usados así como sus respectivas sensibilidades. Cada uno de estos métodos tiene susventajas e inconvenientes, las principales se recogen en la Tabla II.

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Tabla I. Principales métodos para la cuantificación de proteínas y sus rangos de sensibilidad Método Métodos de Absorción A280 A205 A280 - A260 A235 - A280 A224 - A236 A215 - A225 Métodos Derivados Colorimétricos Biuret Lowry Rango de sensibilidad (µg) 100-3000 3-100 100-3000 25-700 5-180 2-45 Coeficiente de extinción oCálculo de la concentración ε280 = 1 mL/mg cm ε205 = 31 mL/mg cm Proteína (mg/mL) = (1.55A280 – 0.76A260) Proteína (mg/mL) = (A235 – A280)/2.51 Proteína (mg/mL) = (A224 – A236)/0.6 Proteína (µg/mL) = 144(A215 – A225)

Bradford BCA Métodos Derivados Fluorimétricos o-ftalaldehido

1000-10000 25-100 a 500 nm 2-30 a 660 nm 1-2 a 750 nm 1-15 0.5- 10 1-5 λexcitación a 340 nm λemisión a 475 nm

ε545= 0.06 mL/mg cm Usar curva estándar ε595 = 81 mL/mg cm Usar curva estándar

Usar curva estándar

Tabla II. Principales métodos para la cuantificación de proteínas, principales ventaja e inconvenientes Método Métodos de Absorción Métodos Derivados Colorimétricos Biuret Ventajas No se pierden las muestras Inconvenientes Interfieren muchos compuestos que absorben en el UV

Lowry

Bastanteespecífico para proteínas Muestra pocas interferencias Es barato Tiene bastante sensibilidad Muy sensible Es el método mas sensible Es el que muestra menos interferencias

Tiene poca sensibilidad

Bradford BCA

No todas las proteínas reaccionan igual Mustra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc. Muestra interferencias con detergentes

Métodos DerivadosFluorimétricos o-ftalaldehido

Muy sensible

La interferencia de aminas contaminantes en la muestra No todas las muestras reaccionan igual

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1.2. Método de Biuret Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas(enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero). 1.3. Método de Bradford Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas. El colorante, en...