Comparación Métodos Pcr

Métodos y Técnicas Avanzadas para la Detección e Identificación de Microorganismos




Índice
OBJETIVO DEL TRABAJO 2
1. COMPARACIÓN DE MÉTODO PCR CON MÉTODOS BASADOS EN CULTIVOS: 2
Bifidobacterias: 2
Muestras: 3
Comparación de dos métodos de detección: 3
1. Métodos tradicionales de enriquecimiento y cultivo en placa: 3
2. PCR para la determinación de Bifidobacterias: 3
Resultados ydiscusión de los métodos tradicionales: 4
Resultados y discusión de PCR: 4
Comparación PCR con los métodos tradicionales: 4
Conclusiones: 5
2. PCR-ELISA: 5
Procedimiento: 5
Estudio: 5
Resultados y discusión: 6
CONCLUSIÓN 6
BIBLIOGRAFÍA 6

OBJETIVO DEL TRABAJO
El objetivo del presente trabajo es comparar diferentes técnicas de determinación de bacterias, con utilidad para el análisisde alimentos. Para ello, hemos seleccionado dos artículos de la bibliografía: “A PCR methods for detection of bifidobacteria in raw milk and raw milk cheese: comparation with cultura-based methods” y “Analysis of Bifidobacterium population in human faecal samples from a consumption trial with Bifidobacterium lactis Bb-12 and a galacto-oligosaccharide preparation”.
A continuación, se presenta unbreve resumen de los artículos y la comparación de las diferentes técnicas empleadas.
1. COMPARACIÓN DE MÉTODO PCR CON MÉTODOS BASADOS EN CULTIVOS:
Bifidobacterias:
Son bacterias gran positivas, no móviles, no formadoras de esporas y anaerobias. Forman parte de la flora intestinal de humanos y animales y generalmente, no son patógenas.
La recepción de leche cruda puede ser el primer puntocrítico en el APPCC de una industria productora de queso. Se ha detectado contaminación fecal, aislándose las mismas especies de Bifidobacteria que se encuentran en el estiércol de las vacas.
En Europa, el indicador fecal control para leche cruda empleada en la producción de quesos es E.coli. Bifidobacteria se ha propuesto como indicador fecal en este estudio al ser estas las más abundantes en hecestanto de origen humano como animal.
Se utilizaron 3 protocolos de enriquecimiento y cultivo en placa usando o no mupirocin (agente selectivo que inhibe otros contaminantes como Lactobacillus) para determinar los niveles de contaminación en Bifidobacterias y comparar estos con los de E. coli. Los resultados se compararon con el método PCR con dos enriquecimientos diferentes.
Muestras:
Muestras deleche cruda: fueron recolectadas de tanques procedentes de granjas francesas. Se hicieron diluciones hasta 10-4.
Muestras de leche cruda para quesos: la leche fue recogida en las explotaciones y se llevó a la industria. Se le añadió nata, fermento y flora superficial para su maduración. La maduración de los quesos duró 28 días.
Se tomaron muestras de la leche cruda (A), después de la adiccióndel cuajo (C), después de la eliminación del molde (E) y durante la maduración (G). Las muestras se diluyeron hasta 10-6 para la detección de Bifidobacteria.
Comparación de dos métodos de detección:
1. Métodos tradicionales de enriquecimiento y cultivo en placa:
Métodos para la determinación de E.coli: Se utilizó Coli ID médium. Medio cromógeno para la detección de E. coli de la casa bioMérieux.Métodos para la determinación de Bifidobacteria:
• Utilización de un medio enriquecido: Brain Heart Infusion.
• Utilización de un medio para aislamiento: Agar sangre Columbia
Los medios de enriquecimiento o aislamiento se prepararon en presencia o en ausencia de mupirocin (agente selectivo). Se realizaron 3 combinaciones:
o Medio enriquecido sin mupirocin/ medio aislamiento con mupirocin.
oMedio enriquecido con mupirocin/ medio aislamiento sin mupirocin.
o Medio enriquecido con mupirocin/ medio aislamiento con mupirocin.
La presencia de bifidobacteria se confirma por la producción de fructosa-6- fosfato (test F6PPK).
2. PCR para la determinación de Bifidobacterias:
• Preparación de ADN:
Cepas puras
Se utilizaron 14 cepas de Bifidobacterias y 37 cepas no Bifidobacterias...