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PRÁCTICA Nº 02
“DETERMINACIÓN DEL NÚMERO TOTAL DE BACTERIAS” , RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO POR EL
METODO DE BREED

I. INTRODUCCIÓN:
Los recuentos microscópicos directos permiten determinar el número de células microbianas, por observación directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja ya que la muestra puede utilizarse tal cual, (si es líquida como leche o cultivos puros en mediolíquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos de recuento.
Se basa en contar icroorganismos en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cámaras del tipo de las de contar glóbulos, o las especialmente diseñadas para contar hongos en alimentos como la cámara de Howard.
Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NOVIABLES) Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se verán azules).
El método de Breed es un método de recuento directobastante simple, fácil y eficaz a pesar de ser un método antiguo (1911). Este método de Conteo Directo al Microscopio (CMD) es usado mayoritariamente para el diagnostico microbiológico de la leche y se lo considera un método rápido para estimar el grado de contaminación bacteriano de la leche pero que no está diseñado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el conteo en placa es máspreciso, más práctico y más barato que un conteo directo ejecutado adecuadamente. Si el método se contemplara como un método para estimar la calidad de la leche con propósito de pago, su uso sería limitado para pequeño número de muestras con alto contenido bacteriano (2.3 x 106 ufc/mL) debido a la insensibilidad del método.
El método de Breed también es usado para diagnóstico de mastitis bovina(diagnóstico subclínico). En ésta, el coloreado con azul de metileno nos permite ver además leucocitos y células somáticas, también se pueden usar coloraciones por los métodos de Levowitz–Weber o Broadhurst–Paley que permiten observar específicamente células somáticas en leche.
II. OBJETIVOS:
Hacer un recuento toral de microorganismos que hay en una muestra (leche).
Emitir juicio de valor sobrela calidad de la leche.

III. MATERIALES:
Microscopio calibrado
Láminas portaobjeto
Lámina patrón de Breed
Pipeta de Breed o asa en anillo calibrado
Colorante de Gram o Azul de metileno
Xilol
Papel Tisú
Muestra: leche









IV. PROCEDIMIENTO:

Estandarización del equipo
- El microscopio se estandariza.
- Los microscopios usados deben tener un factor microscópico de 300mil – 600 mil el cual debe ser estandarizado cuando se compra el equipo.

Determinación del factor microscópico (FM)
- Colocar la lámina patrón que está medida en micrómetros y las divisiones son de 0,1 y 0.01.
- La lámina se coloca en la platina.
- Con el objetivo de inmersión se procederá de la siguiente manera:
a) Hacer coincidir con el borde y medir el campo microscópico dado en 3unidades colocando hasta el tercer decimal.
b) Determinar el área en mm2 aplicando la fórmula del círculo:



Donde:
= 3.1416; r = ½ del diámetro del campo

Preparación de la película
- Desengrasar el portaobjeto.
- La lámina se coloca sobre el cartón (lámina patrón de Breed).
- Prender mechero y muestra se homogeniza (20 veces), esto se realiza para que la grasa sedesprenda totalmente (si son porongos grandes remover la leche y después se toma la muestra porque la grasa es bastante importante.
- Luego sacar 0.01 de muestra.
- Ya retirada la muestra se coloca en el cuadradito y cubrir y extender sobre el cuadradito (la posición de la pipeta debe ser vertical).
- Luego secar la película a una temperatura moderada de 40º - 45º C /5 minutos con cuidado de...