Concentración y actividad enzimática



Universidad Austral de Chile
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Facultad de Ciencias
Escuela de Bioquímica


Efecto de la Concentración de Enzima en la Actividad Enzimática

Integrantes: Daniela B. Carrasco Moraga
S. Vaitiare Pacheco Muñoz
Asignatura: Bioq 221
Profesor (a): ClaudiaQuezada


Objetivos:
-Estudiar la influencia de la concentración de enzima fosfatasa alcalina sobre la actividad enzimática.
-Determinar los valores actividad enzimática y específica de la fosfatasa alcalina a través de un ensayo cinético continúo.
-Determinar el efecto que se produce en la velocidad de la reacción con las distintas concentraciones de enzima fosfatasa a través de un ensayocinético.

Resultados
Para poder medir la velocidad inicial de la reacción catalizada por fosfatasa alcalina (hidrolisis de grupos fosfato),realizamos un ensayo del tipo continuo en un espectrofotómetro midiendo a una longitud de onda de 405 nm para obtener primeramente la concentración de producto formado de p-nitrofelato en un intervalo de tiempo de cada 5 segundos por un minuto y 20segundos para cuatro reacciones con concentraciones de enzima distinta para así obtener un gráfico de actividad enzimática y específica, para esto primero debemos calcular:
Por lo que realizamos las mediciones del cambio de absorbancia para las cuatro reacciones para esto se agregaron 0,95 ml de sustrato y 50 µl de las distintas concentraciones de enzima obteniendo:
Concentración de enzima FA
0,0250,050
0,075
0,100
∆A/min
0,224
0,431
0,650
0,904

1-Concentracion de Producto Formado
A partir del ∆A/min obtenido durante el ensayo de actividad enzimática y con el ɛ = 17.900 conocido a 405 nm, y camino óptico de 1 cm, obtenemos la Concentración de producto formado y lo convertimos a µM.


Tomaremos como ejemplo para nuestros cálculos la primera reacción.
Usamos la Ley deLamber-Beer: A = ɛ x l x C y reemplazamos:
= 1.251x10¯⁵ M = 12.514 µM de p-nitrofenolato.
2- La velocidad de Reacción (U).
Tiene unidades de µmoles/min y es la generación de µmoles de producto formado de p-nitrofenolato. Utilizamos el volumen total de la ensayo (1ml).
12.514 µM =
Entonces: 12.514 µmoles x 0.001 lt = 12. 5x10¯³µmoles/min
3- Actividad Enzimática
Son las unidades enzimáticas presentes en el volumen de enzima adicionado (50 µl).
= 0.25 U/ml
4- Actividad Específica
La concentración de la primera solución estándar fue de 0.025 mg/ml de fosfatasa alcalina, y se usaron 50 µl.
= 1.25x10¯³ mg de proteína en la solución.
Ahora que tenemos la concentración de proteína usamos la fórmula para obtener laActividad Específica:
Ae = U totales/mg de proteína
Ae = = 10 U/mg
También la podemos calcular así:
= 10 U/mg
5- Cálculos del Factor K
Sabemos que: U/ml = ∆A/min x K
Donde k es un valor tal que al multiplicarse con ∆A/min nos da el valor de U/ml. K entonces puede contener distintos factores, como el de dilución, ɛ y la conversión de litros a ml. Lo ordenamos así:
U/ml = ∆A/min x xK reemplazamos 0.250 =0.224 x xK
Al despejar obtenemos que k = 0.0558, casi lo mismo que = = 5.58 x10¯⁵ multiplicado por el factor de conversión para pasar de litros a ml.
U/ml = ∆A/min x x x 1000
Considerando todos los cálculos realizados, a continuación se muestra una tabla resumen para los 4 ensayos cinéticos de las cuatro concentraciones distintas de enzima.
Ensayo
[FA](mg/ml)
Concentración Producto (µM/min)
Velocidad de Reacción (µmoles/min)
Actividad Enzimática (U/ml)
Concentración Proteína (mg/ml)
Actividad Específica (U/mg)
1
0,025
12,514
12,5x10¯³
0,250
1,25x10¯³
10,00
2
0,050
24,078
24,1x10¯³
0,482
2,50x10¯³
9,640
3
0,075
36,313
36,3x10¯³
0,726
3,75x10¯³
9,683
4
0,100
50,503
50,5x10¯³
1,010
5,00x10¯³
10,10
Gráficos con...