Construccion de vectores plasmidiales










Construcción bioinformática de vectores plasmidiales
PRACTICO VII













INTRODUCCIÓN
Actualmente la clonación es un método crucial para obtener una gran cantidad de producto de un gen en particular, la generación de bibliotecas genómicas, amplificación de unfragmento especifico y otras. Para poder llevar a cabo estos métodos de clonación la principal etapa a considerar es la extracción y purificación del vector que necesitemos utilizar, una de las técnica a utilizar es través de “miniprep”, técnica mediante la cual las células son lisadas químicamente y se logra separar el ADN genómico del plasmidio y el debris celular.
Los vectorescorresponden a moléculas de ADN que tiene la particularidad de autoreplicarse y que pueden transferir material genético externo hasta el interior de la célula. Los vectores que pueden ser utilizados para realizar funciones particulares según su utilidad:
Plásmidos (10 kb)
Bacteriófagos (20 kb)
Cosmidos (50 kb)
YACs (200- 800 kb) (cromosomas artificial de levaduras)
Para realizar una elección delvector se debe considerar tamaño de las moléculas de ADN que serán insertadas en el vector; la supervivencia del clon recombinante en el cultivo y la expresión del DNA target en las células. La utilización de vectores o desarrollo de estos mismos ha sido usada para una variedad de fines específicos, incluyendo la producción de ADN mono hebra, alto nivel de expresión de genes que codifican proteínasy la producción de ARN (Richard J., et al 2004).
Existen variados ejemplares de vectores, los cuales son utilizados para realizar la técnica de clonación, dentro de esta gama de vectores se encuentran, los vectores de clonaje, los cuales cumplen el rol de mantener estable la molécula recombinante que se encuentra dentro de la célula huésped y por otra parte existen los vectores de expresión, cuyorol radica en aportar las señales que sean necesarias para efectuar tanto el proceso de transcripción como de traducción de la secuencia del inserto elegido.
Los hospedadores que se pueden encontrar en una técnica de clonación, son básicamente de dos tipos, los hospedadores intermediarios, el cual solo es utilizado para obtener una replicación del ADN recombinante o para estudios de expresión;por otro lado se encuentran los hospedadores definitivos, los cuales son receptores del gen que se ha clonado.
Comúnmente se utiliza Escherichia coli, como hospedador definitivo esto debido que es un microorganismo de rápida expresión, se conocen protocolos bien definidos, y posee una manipulación genética fácil aunque de todos modos no se encuentra exenta de desventajas, ya que cuando esta esutilizada para expresar genes en organismos de tipo eucarionte, ocurren problemas ya que esta no posee una maquinaria transcripcional.
Cuando se logra la transferencia exitosa del plásmido dentro de la célula, comienza la asimilación del material genético externo, para esto la célula debe ser sometida previamente a una permeabilización de la membrana, la cual puede ser llevada a cabo por shocksde corriente eléctrica.
Los métodos de validación para verificar si el fragmento de ADN externo se ha insertado de manera correcta dentro del vector, van desde el uso de antibióticos o la realización de screening.
En este trabajo se abordara el diseño de Vector de clonación y expresión de Pyrococcus furiosus utilizando como herramienta bioinformática el Vector NTI Advance.
Pyrococcusfuriosus, corresponde a una especie perteneciente al dominio Archeae, extremófila, cuya temperatura óptima de crecimiento es de 100°C, además posee la particularidad de ser uno de los pocos organismos que posee la enzima tungsteno, el cual raramente es encontrado en moléculas biológicas.
El nombre Pyrococcus significa "coco de fuego" y furiosus, "ímpetu", haciendo referencia a su rápido crecimiento a...