conteo de bacterias

TÉCNICAS PARA EL CONTEO TOTAL DE BACTERIAS

I.METODO DE BREED
Conteo microscópico directo por el método de Breed, un volumen conocido de la muestra (generalmete 0.01) se extiende sobre un portaobjetos normal en una superficie conocida. Se examina en un microscopio calibraod, donde se conoce el diámetro del campo microscópico. Se cuentan las células en diversos campos. Se obtiene el valormedio de células por campo y se multiplica por el número de campos microscópicos comprendidos de la preparación. El resultado correspode al número de células en el volumen extendido (0.01ml). multiplicando este valor por 100 se obtiene en núemro total de organismos por ml o por gr de muestra.
1.-En un poratobjetos limpio y desengrasado, marcar un área de 2cm2 e invertir la laminilla.
2.-Depositar0.01ml de un cultivo y extender en el area marcadad3el portaobjetos, dejar secar a temperatura ambiente.
3.- fijar con calor y teñir con azul de metileno de löeffler.
4.-lavar con agua de la llave, dejar secar a temperatura ambiente.
5.- colocar el objetivo micrometrico de platina del microscopio y observar a 100x .
6.- medir el diametro del campo del microscopio.
7.- cada division delobjetivo micrometrico mide 10mm=(0.01mm=0.001cm).
8.-determinar la superficie del campo microscópico con la siguiente ecuación.
R2 en cm *3.1416= superficie de campo
Microscopio en cm
9.-determine el numero de campos microscópicos que existen en la preparacion con la fórmula:
Superficie de la preparacion = número decampos microscópicos
Superficie del campo microscopico
10.-coloque en la platina del microscopio la preparacion teñida de las bacterias y cuente las bacterias en 10 campos. Obtenga el valor medio de organismos por campo microscopico.
11.- calcule el número de bacterias que hay en la preparacion (0.01ml) y en 1ml del cultivo, con la fórmula
#de bacterias X #de campos = #de bacterias X100 =#bacterias/ml
por campo microscópicos en la preparacion de cultivo.
II. CONTEO POR EL MÉTODO DE LAS DILUCIONES Y VACIADO EN PLACA
Es un recuento de células bacterianas vivas solamente.
1.-preparar 7 tubs de ensayo de 16X150mm con 9ml de diluyente estéril cada uno (agua peptonada al 0.1% o una solución salina isotonica). Márquelos con las diluciones desde 1X10-2 hasta 1X10-8.
2.- marque 7cajas petri vacias estériles con los mismos números de las diluciones. Haga duplicados con otras 7 cajas.
3.-en condiciones estériles tome 10ml de una suspensión bacteriana (puede ser E.colí), con una pipeta estéril y deposítelos en el frasco con un diluyente. Dscarte la pipeta y colóquela en un frasco con desinfectante.
4.- tape el frasco con la muestra y agite vigorosamente, aproximadamente 25veces. Esta será la dilución 1:10.
5.-con una nueva pipete estéril distibuya alícuotas de 1ml y transfiera al tubo de la dilución 1:100, mezclando en igual forma y descartando la pipeta.
6.- con una nueva pipeta distribuya alícuotas de 1ml al tubo de la dilución 1:100 y a las dos cajas de petri corresspondientes marcadas. Descarte la pipeta.
7.-repita el procedimeinto mezclando bien ladilución 1:1000 y con una nueva pipeta distribuya alícuotas al tubo de la siguiente dilución y sus dos cajas correspondientes y así sucesivamente con las siguientes diluciones..
8.-enseguida adiciones a cada caja aproximadamente 20ml de medio de cultivo previamente fundido y mantenimiento a 50°C. al tapar cada caja vaya mezclando el contenido muy cuidadosamente, para que no derrame el líquido.
9.- dejesolidificar e incube 24hrs a 37°C.
10.- cuente las colonias desarrolladas bajo la cámara cuentacolonias. Calcule la cantidad de colonias por ml o por g de muestra mediante la siguiente fórmula:
Promedio de colonias contadas X reciproco de la dilución = UFC/ml
III. CURVA DE CRECIMIENTO.
1.-obtenga un cultivo de E.coli de 24 hrs en caldo nutritivo
2.- siembre 0.1ml del cultivo en tubos con...