Conteo de esporas
Páginas: 9 (2136 palabras)
Publicado: 7 de octubre de 2010
ANEXO 1 Conteo en cámara de Neubauer. Esta cámara se utiliza para conteo celular. • • • • Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en ladistribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. • La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminacionesdel recuadro. Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará lo siguiente.
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•
Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:
•
En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales secuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la
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cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara de conocecomo AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:
•
Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momentodel conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son las que no se deben contar.
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•
Después de contar las células se procede a calcular la elnumero de células por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.
•
Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo, se multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contóel cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor X.
Si 1ml del preinoculo ?
____________ X esporas
____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas)
Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.
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ANEXO 2 Método delÁcido Dinitrosalicílico (DNS) Pasos para preparar DNS: • • • • • Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC
Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón con lasiguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4. Procedimiento: • • • • • • • • Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS. Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos. Enfriar con hielo. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Agitar y...
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Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:
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En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales secuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la
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cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la cámara de conocecomo AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera:
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Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momentodel conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son las que no se deben contar.
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Después de contar las células se procede a calcular la elnumero de células por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.
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Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo, se multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contóel cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor X.
Si 1ml del preinoculo ?
____________ X esporas
____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas)
Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.
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ANEXO 2 Método delÁcido Dinitrosalicílico (DNS) Pasos para preparar DNS: • • • • • Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC
Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón con lasiguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4. Procedimiento: • • • • • • • • Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS. Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos. Enfriar con hielo. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Agitar y...
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