CORPORACION UNIVERSITARIA DEL CARIBE
Páginas: 13 (3190 palabras)
Publicado: 20 de marzo de 2015
CORPORACION UNIVERSITARIA DEL CARIBE
CECAR
BIOQUIMICA
PASOS PARA SECUENCIAR UN PEPTIDO METABOLISMO CELULAR
ROLANDO RAMOS CONDE
SECUENCIACIÓN DE UN PÉPTIDO
Los péptidos se pueden secuenciar (establecer el orden en que se encadenan los aminoácidos en la secuencia) automáticamente utilizando el reactivo de EDMAN que separa y derivatiza el aminoácido N-terminal. Se realizanciclos automáticos de separación e identificación cromatográfica. Más allá del aminoácido 20 o 30 el resultado ya no es fiable. Los péptidos se pueden secuenciar también por espectrometría de masas. Los péptidos son automáticamente fragmentados y de la masa de los fragmentos se deduce la secuencia.
La posición que ocupa cada aminoácido dentro de la cadena polipeptídica, esto es lasecuencia, constituye el primer nivel estructural de las proteínas, su estructura primaria. La secuencia de un péptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales.
La insulina bovina fue la primera proteína que se secuenció completamente por
Sanger en 1953, lo que le valió el premio Nobel. La determinación de la secuencia de la insulina fue elresultado del trabajo de muchos científicos durante 10 años, desde entonces se han secuenciado miles de proteínas.
La secuencia de una proteína, si conocemos el gen del que proviene, puede obtenerse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero también puede hacerse la secuenciación química directa. Los pasos a seguir son:
• Determinación de la composición del péptido por hidrólisis total y posterioranálisis cromatográfico.
• Determinación de los extremos C-terminal y N-terminal
• Fragmentación por hidrólisis selectiva
• Secuenciación: Degradación de Edman
La determinación de la composición del péptido se realiza por hidrólisis total presencia de HCl 6N, calentando a 100 °C durante 10-24h, y en tubo al que se le ha hecho el vacío. Tras el proceso se utiliza un sistema cromatográfico quepermita separar y determinar cuántos y cuáles son los aminoácidos que forman la cadena.
Hay distintos métodos que permiten determinar el primer aminoácido (Resto Nterminal) o el último (Resto C- terminal) de una cadena polipeptídica.
• La determinación del resto N-terminal, se puede realizar, entre otros métodos,
Mediante la Degradación de Edman: en este proceso el péptido reacciona con fenilisotiocianato que se une selectivamente al primer aminoácido. A continuación se escinde con HF anhidro el aminoácido marcado, separándolo del resto selectivamente con un disolvente orgánico. Tras un tratamiento en medio ácido el compuesto resultante se determina cromatográficamente.
(Figura 6).
Figura 6.
Determinación de la secuencia de un péptido. Hidrólisis total de laproteína. (a).
Determinación del primer aminoácido utilizando 2,4-dinitrofluorobenceno (b) o
fenilisotiocianato (c). Este último método también se conoce como degradación de
Edman y permite la secuenciación del péptido.
Tema 4. Aminoácidos y péptidos Bioquímica
• Por otro lado, la determinación del
resto C-terminal, se puede realizar
con Hidracina: este compuesto
reacciona con todos los enlacespeptídicos del péptido, provocando
la hidrólisis de los mismos y dando
lugar a aminoacil-hidracinas con
todos los aminoácidos excepto con
el último (C-terminal), pudiendo
separarse del resto fácilmente y
determinarse con posterioridad su
naturaleza.
La fragmentación por hidrólisis parcial es necesaria porque por lo general no pueden secuenciarse péptidos con más de 20 o 30 aminoácidos. Serealiza con reactivos selectivos, en la mayoría de los casos se utilizan proteasas, enzimas que hidrolizan determinados enlaces peptídicos.
• La tripsina hidroliza por la derecha de Arg , Lys
• La quimotripsina hidroliza por la derecha de Phe, Trp, Tyr
• La pepsina hidroliza por la izquierda de Phe, Trp, Tyr
• La termolisina hidroliza por la izquierda de Val, Leu, Ile
• El bromuro de cianógeno...
CECAR
BIOQUIMICA
PASOS PARA SECUENCIAR UN PEPTIDO METABOLISMO CELULAR
ROLANDO RAMOS CONDE
SECUENCIACIÓN DE UN PÉPTIDO
Los péptidos se pueden secuenciar (establecer el orden en que se encadenan los aminoácidos en la secuencia) automáticamente utilizando el reactivo de EDMAN que separa y derivatiza el aminoácido N-terminal. Se realizanciclos automáticos de separación e identificación cromatográfica. Más allá del aminoácido 20 o 30 el resultado ya no es fiable. Los péptidos se pueden secuenciar también por espectrometría de masas. Los péptidos son automáticamente fragmentados y de la masa de los fragmentos se deduce la secuencia.
La posición que ocupa cada aminoácido dentro de la cadena polipeptídica, esto es lasecuencia, constituye el primer nivel estructural de las proteínas, su estructura primaria. La secuencia de un péptido tiene gran importancia porque entre otras cosas condiciona los siguientes niveles estructurales.
La insulina bovina fue la primera proteína que se secuenció completamente por
Sanger en 1953, lo que le valió el premio Nobel. La determinación de la secuencia de la insulina fue elresultado del trabajo de muchos científicos durante 10 años, desde entonces se han secuenciado miles de proteínas.
La secuencia de una proteína, si conocemos el gen del que proviene, puede obtenerse indirectamente, secuenciando dicho gen. Pero también puede hacerse la secuenciación química directa. Los pasos a seguir son:
• Determinación de la composición del péptido por hidrólisis total y posterioranálisis cromatográfico.
• Determinación de los extremos C-terminal y N-terminal
• Fragmentación por hidrólisis selectiva
• Secuenciación: Degradación de Edman
La determinación de la composición del péptido se realiza por hidrólisis total presencia de HCl 6N, calentando a 100 °C durante 10-24h, y en tubo al que se le ha hecho el vacío. Tras el proceso se utiliza un sistema cromatográfico quepermita separar y determinar cuántos y cuáles son los aminoácidos que forman la cadena.
Hay distintos métodos que permiten determinar el primer aminoácido (Resto Nterminal) o el último (Resto C- terminal) de una cadena polipeptídica.
• La determinación del resto N-terminal, se puede realizar, entre otros métodos,
Mediante la Degradación de Edman: en este proceso el péptido reacciona con fenilisotiocianato que se une selectivamente al primer aminoácido. A continuación se escinde con HF anhidro el aminoácido marcado, separándolo del resto selectivamente con un disolvente orgánico. Tras un tratamiento en medio ácido el compuesto resultante se determina cromatográficamente.
(Figura 6).
Figura 6.
Determinación de la secuencia de un péptido. Hidrólisis total de laproteína. (a).
Determinación del primer aminoácido utilizando 2,4-dinitrofluorobenceno (b) o
fenilisotiocianato (c). Este último método también se conoce como degradación de
Edman y permite la secuenciación del péptido.
Tema 4. Aminoácidos y péptidos Bioquímica
• Por otro lado, la determinación del
resto C-terminal, se puede realizar
con Hidracina: este compuesto
reacciona con todos los enlacespeptídicos del péptido, provocando
la hidrólisis de los mismos y dando
lugar a aminoacil-hidracinas con
todos los aminoácidos excepto con
el último (C-terminal), pudiendo
separarse del resto fácilmente y
determinarse con posterioridad su
naturaleza.
La fragmentación por hidrólisis parcial es necesaria porque por lo general no pueden secuenciarse péptidos con más de 20 o 30 aminoácidos. Serealiza con reactivos selectivos, en la mayoría de los casos se utilizan proteasas, enzimas que hidrolizan determinados enlaces peptídicos.
• La tripsina hidroliza por la derecha de Arg , Lys
• La quimotripsina hidroliza por la derecha de Phe, Trp, Tyr
• La pepsina hidroliza por la izquierda de Phe, Trp, Tyr
• La termolisina hidroliza por la izquierda de Val, Leu, Ile
• El bromuro de cianógeno...
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