Corte De DNA Con Enzimas De Restricci N

Guía Unificada de Laboratorios

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GLA-01 V. 00

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AUTOR: JORGE CONTRERAS PINEDA
1. Titulo
Corte de DNA con enzimas de restricción
2. Objetivo
Conocer los conceptos básicos y aplicarlos en la digestión de DNA útiles en
diversos procedimientos de DNA recombinante
3. Marco teórico
Los sistemas de metilación-restricción son procesos naturales en las bacterias,
corresponden a unmecanismo de defensa para destruir DNA foráneo que puede ingresar
a la bacteria, fundamentalmente se adquirieron para destruir DNA de los virus que
puedan infectarlas. Hay 3 tipos de sistemas de restricción, para este caso hablamos del
sistema tipo II, el cual corresponde a enzimas que reconocen secuencias palindrómicas y
cortan el DNA en la misma secuencia a la que se unen.
Restricción podríainterpretarse como permitir la existencia del DNA propio y destruir
DNA foráneo, la otra intepretación es que no cortan el DNA de manera inespecífico sino
que cortan en solo determinados sitios dependiendo de la secuencia, las enzimas de
restricción destruyen el DNA en secuencias específicas para cada una de ellas. Una de
las características de las enzimas de restricción es que las secuenciasreconocidas y a
través de las cuales ellas actúan son secuencias palindrómicas.

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Un ejemplo de una secuencia palindrómica es el siguiente:
5’ GATC 3’ (primera cadena)
3’ CTAG 5’ (cadena complementaria)
Como puede observarse, la primera cadena en dirección 5’ a 3’ se lee GATC y la cadena
complementaria endirección 5’ a 3’ también se lee GATC, haciendo referencia al
material genético esto corresponde a una secuencia palindrómica. Cada enzima de
restricción reconoce su propia secuencia palindrómica. Entre más corta sea la secuencia
palindrómica mayor número de sitios de corte habrá para esa enzima de restricción y
viceversa.
Para un determinado segmento de material genético se puede establecer lalocalización
y número de secuencias palindrómicas reconocidas por una o varias enzimas de
restricción. Esta información produce los denominados “mapas de restricción”. Mapa del
plásmido pUC19, ver gráfico de la página anterior.
El nombre de una enzima de restricción se deriva de la bacteria en la cual fue
encontrada, por ejemplo, EcoRI, corresponde a una enzima encontrada en Escherichia
coli, HindIII,corresponde a una enzima aislada de Haemophilus influenzae y Sau3A1
corresponde a una enzima de Staphylococcus aureus. Actualmente se conocen cientos
enzimas de restricción.
El sistema se denomina restricción y metilación porque en el DNA de la bacteria también
se encuentran las secuencias palindrómicas, pero no pueden ser reconocidas ni cortadas
por la enzima de restricción debido a que algunade las bases de la secuencia está
metilada. A través de la metilación el DNA bacteriano es protegido de la degradación y
solo son destruidas las secuencias no metiladas.
Al cortar el DNA una enzima de puede producir extremos romos o extremos pegajosos
(cohesivos) en los fragmentos de DNA que se producen. Ejemplos:
BamHI produce extremos cohesivos.

3' C-C-T-A-G
5'



5' G┼G– A - T- C - C 3'
3' C -C –T - A- G┼G 5'
5' G
3'



G-A-T-C-C

DraI produce extremos romos:

5' T-T-T┼A-A-A 3'
3' A-A-A┼T-T-T 5'

G

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5' T-T-T
3' A-A-A

A-A-A 3'
T-T-T 5'

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La re-asociación de DNA con extremos cohesivos es más probable y por lotanto más
fácil, pero exige que los dos DNA que se quieren unir sean cortados con la misma
enzima o que al cortar dejen los mismos extremos; la re-asociación con extremos
romos es menos probable y por tanto más difícil, aunque permite unir DNA cortado
con diversas enzimas que dejen extremos romos.
Una vez descubierto, caracterizado y aislado este sistema natural de restricciónmetilación se...