Cristalizacion Proteina

Práctica nº 5: Cristalización de proteínas
Claudia Machicado. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular & Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos. Facultad de Ciencias. Universidad de Zaragoza


1. INTRODUCCION


La característica principal de un cristal es su estructura interna periódica y ordenada en tres dimensiones. El hecho de que un sistemarenuncie a sus grados de libertad parece una contradicción desde el punto de vista entrópico y, sin embargo, la cristalización de moléculas es un fenómeno espontáneo y reversible cuyos parámetros cinéticos y termodinámicos dependen de las propiedades químicas y físicas del solvente y del soluto involucrados. La cristalización se produce cuando, bajo ciertas condiciones (de supersaturación), elsistema se dirige hacia el estado de equilibrio entre dos fases, una soluble y una sólida. A pesar de que las moléculas individuales pierden libertad rotacional y translacional, disminuyendo así la entropía del sistema, establecen al mismo tiempo nuevas interacciones. Esto reduce la energía libre del sistema y provée la fuerza directriz del proceso de ordenamiento. Las moléculas, por tanto,cristalizan minimizando su energía libre al disponerse periódicamente en unidades repetitivas y simétricas en el estado sólido, maximizando las interacciones intermoleculares favorables.
La solvatación es un factor vital para la cristalización de macromoléculas. En soluciones extremadamente concentradas, donde no hay agua suficiente para mantener la hidratación, las moléculas pueden o bien agregar comoun precipitado amorfo o bien cristalizar (figura 1). La estrategia para inducir la cristalización consiste en llevar al sistema hacia el estado de mínima solubilidad lentamente y lograr así un grado limitado de supersaturación. Para lograr que las moléculas tengan oportunidad de formar el mayor número de interacciones favorables con los vecinos se modifican las propiedades del solvente conagentes precipitantes o se alteran algunas propiedades físicas como la temperatura.


2. MÉTODOS PARA CRISTALIZAR


La determinación de la estructura cristalográfica empieza con el crecimiento de un cristal adecuado. Para ello pueden aplicarse distintos métodos que se diferencian por las condiciones y solutos que emplean. Para decidir el método mejor para cristalizar una proteína determinadadebemos entender los fundamentos de la cristalización.
La formación de un cristal de proteína macroscópico que contiene hasta 1015 moléculas, empieza con la aparición de agregados de proteína mediante contactos intermoleculares (agregación). Estos agregados prenucleares eventualmente alcanzan el tamaño nuclear crítico. Una vez formado un núcleo estable (nucleación), el crecimiento prosigue por laadición de moléculas a la red cristalina. Tanto la nucleación del cristal como el crecimiento ocurren en soluciones supersaturadas donde la concentración de proteína es mayor que su valor de solubilidad en equilibrio. La región del parámetro de solución aconsejable para la cristalización viene recogida en el diagrama de fase (figura 2).
La supersaturación es una función de la concentración dela macromolécula y de diversos parámetros que afectan su solubilidad. En general, se logra a altas concentraciones de macromoléculas y a valores crecientes de parámetros de solución reductores de la solubilidad macromolecular. Los factores que pueden influir en la solubilidad proteica son por ejemplo, la inclusión de aditivos tales como alcoholes, polímeros hidrofílicos y detergentes que puedandisminuir la solubilidad proteica. Estos son agentes precipitantes ya que influyen en la solubilidad, pudiendo causar la precipitación macromolecular. Otro factor que influye sobre la solubilidad proteica es la presencia de sal, que varía generalmente como una curva asimétrica en forma de campana indicando que la solubilidad decrece tanto a altas como a bajas concentraciones de sal. Parámetros de...