cristalizacion

La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal. No es objeto de estas páginas hacer una presentación exhaustiva de las diferentes técnicas de cristalización que se pueden encontrar en muchos libros de texto o en diferentes páginas web, y sólo nos detendremos brevemente en algunas de las técnicasmás extendidas que se usan para obtener cristales de proteínas.

El experimento de cristalización comienza con una solución de proteína relativamente concentrada (entre 2 y 50 mg/ml) a la que, de algún modo, se le añade lentamente algún reactivo, con la intención de reducir la solubilidad de la proteína y generar una precipitación controlada de la misma. Si posteriormente se fuerza un incrementopaulatino de concentración y se controlan las condiciones normalmente se generan diminutos núcleos cristalinos cuyo ulterior crecimiento puede dar lugar a cristales de tamaño adecuado para los experimentos de difracción (entre 0.1 y 0.5 mm).


Los esquemas superiores muestran, genéricamente las diferentes zonas de un sistema proteína-precipitante en función de las concentraciones de amboscomponentes.

Las zonas de color amarillo (izquierda) y blanco (derecha) representas las condiciones en las que la proteína estaría solubilizada. En la zona de color azul la proteína dejaría de ser soluble y aparecería como un precipitado. Ambas zonas están separadas por otra (de color rosa) en donde existe una ligera sobresaturación, idónea para la nucleación y crecimiento cristalino.

Por lotanto, para maximizar la posibilidad de éxito de un intento de cristalización, es necesario diseñar distintos experimentos, partiendo de diferentes posiciones iniciales, es decir, de diferentes concentraciones de proteína y precipitante (flechas de diferentes colores en el esquema de la derecha).

El método más común para estos experimentos es el basado en la técnica de la gota colgante.

Secolocan unos pocos microlitros (1-2 μl) de la solución de proteína en el centro de un cubre-objetos de vidrio y se le añaden otros tantos microlitros de la solución del precipitante contenido en un pocillo, al cual previamente se le ha equilibrado su pH mediante un tampón. El cubre-objetos que contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta y con él se tapa el pocillo mencionado. Este sistemacerrado evolucionará por equilibrio de vapor y como la mezcla de proteína y precipitante en la gota está menos concentrada que la solución de precipitante en el pocillo, el agua de ésta se evaporará, uniéndose a la solución del pocillo. Como resultado de este proceso, la concentración de la proteína y del precipitante aumentarán lentamente en la gota, y si las condiciones son las adecuadas, se formaráncristales.

En el mercado existen cajas que contienen un número elevado de estos pocillos (24 o más), de tal modo que se puedan etiquetar y almacenar con facilidad para su ulterior observación a través de una lupa-microscopio, tal como se muestra en la figura de abajo.



Si las condiciones son adecuadas, los cristales crecen en la gota con la apariencia que se muestra en la imagensuperior, tomada a través de una lupa-microscopio.



Como ayuda en la preparación de las diferentes condiciones de inicio, se han desarrollado robots de cristalización que simplifican mucho el proceso manual para rellenar las cajas que contienen las diferentes condiciones de prueba, pudiéndose llenar una caja de cristalización en segundos.




 
Crecimiento cristalino


Monocristal delizosima para estudio por difracción de rayos X.
Para obtener cristales grandes de productos poco solubles se han desarrollado otras técnicas. Por ejemplo, se puede hacer difundir dos compuestos de partida en una matriz gelatinosa. Así el compuesto se forma lentamente dando lugar a cristales mayores. Sin embargo, por lo general, cuanto más lento es el proceso de cristalización tanto mejor suele ser...