Cromatografáa por exclusión molecular




INTRODUCCION
Con la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces químicos para formar una red tridimensional.

OBJETIVOSDeterminar algunos parámetros que caracterizan al lecho cromatográfico
Efectuar la desalación de la albumina, utilizando la técnica de cromatografía por exclusión

1. Determinación del volumen vacio (V0) de la columna
Tabla 1.Determinacion del volumen vacio (Vo) de la columna
Volumen de elución (mL)
A 615
3
Blanco
6
0.003
9
0.003
12
0.003
15
-0.002
18
0.258
21
0.549
24
0.322
270.114
30
0.028
33
0.005
36
0.004
39
-0.002










a) ¿Cuál es el volumen total de la columna (VT)?
Sabiendo el diámetro de la columna y la altura del lecho cromatografíco es posible obtener VT

r= 0.9 cm
h= 24.5 cm


b) ¿Cuál es el volumen vacio de la columna (Vo)? ¿Qué importancia tiene determinarlo?
El volumen vacio será el volumen de elución de aquella fracción querepresente mayor absorbancia, por lo tanto el volumen de elución obtenido es de 21 mL
El volumen vacio es el espacio que existe entre las esferas del gel y siendo el principio de la cromatografía por exclusión la diferencia en tamaño molecular, al determinar el Vo con la dextrana azul 2000 se esperara que en la desalación de la albumina las moléculas de mayor tamaño que no puedan penetrar en elinterior de los poros de las esferas recorran únicamente el volumen vacio, siendo las primeras en salir. Una buena separación conllevará a un volumen de elución de la albumina igual o similar al volumen vacio
c) Determine el volumen que ocupa en la columna el liquido que se encuentra en el interior de la estructura del gel (Vi)y el volumen del gel solo (Vg)
1g de Sephadex® hidratado el volumendel lecho cromatografico es de 5mL, el volumen del lecho cromatografico obtenido fue de 62.3949 mL, por lo tanto

1g de Sephadex® seco puede retener 2.5 mL de agua


De la ecuación
Donde
Volumen total =62.3449 mL
Volumen vacio= 21 mL
Volumen interno =31.1722 mL
Volumen del gel
Se obtiene que


2. Separación de la proteína del sulfato de amonioTabla 2. Separación del sulfato de amonio y la albumina
Volumen de elución
A 280
Masa del tubo vacio (g)
Masa del tubo con precipitado seco (g)
(NH4)2SO4
(mg)
3
Blanco
6.3023
-
-
6
-0.004
6.3025
-
-
9
-0.007
5.2043
-
-
12
-0.009
6.2767
-
-
15
-0.006
9.7617
-
-
18
-0.005
8.6036
-
-
21
0.405
9.892
-
-
24
0.313
8.6858
-
-
27
0.118
8.6808
-
-
300.051
6.4385
6.4538
0.0153
33
0.036
8.8945
8.9082
0.0137
36
0.02
8.8151
8.8566
0.0415
39
0.016
6.4439
6.5105
0.0666
42
0.025
8.8642
8.9136
0.0494
45
0.017
8.799
8.8265
0.0275
48

8.8068
8.8168
0.01
51

6.2705
6.2916
0.0211
54

8.6015
8.6035
0.002
57

8.9114
-
-
60

8.864
-
-
63

6.2673
-
-
66

8.8564
-
-
69

8.8012
-
-
728.8385
-
-
75

8.7126
-
-





a) ¿Qué sustancia eluyó primero y cual después? Explique porque
El intervalo de fraccionamiento para proteínas del Sephadex G-25 es de 1000-5000 Daltones, si consideramos el hecho de que la seroalbumina su peso molecular promedio es de 67000 daltones y el del sulfato de amonio de 132 g/mol, teóricamente se esperaría que la seroalbumina sea quien eluyaprimero, puesto que será de tamaño mayor y solo podrán moverse en el espacio que queda entre las esferas, mientras que las moléculas de sulfato de amonio penetraran a los poros de las esferas y verán retrasado su descenso eluyendo al final. Esto se corroboro con el volumen de elución en que se obtuvo la mayor absorbacnia de seroalbumina(21 mL), siendo este el mismo que se obtuvo de volumen vacio de...