Cromatografía De Exclusión Molecular

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Ingeniería Bioquímica
Laboratorio de Métodos de análisis
Métodos de análisis


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Práctica 8
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Determinación del peso molecular de una proteína usando cromatografía por exclusión molecular

GRUPO: 4IM1
SECCIÓN: 2
PROF:Joaquín Cordero Martínez
FECHA DE REALIZACIÓN: miércoles 11/04/12-18/04/12
FECHA DE ENTREGA: Miércoles 18/Abr/2012
Situación Escolar: Alumna regular, inscrita

“Daría todo lo que sé por la mitad de lo que ignoro”. Descartes

Métodos de análisis

OBJETIVOS___________________________
* Utilizar el gel apropiado para eluir proteínas de peso molecular conocido y determinar el volumende elución (Ve).
* Realizar una gráfica que relacione los volúmenes de elución relativos (Ve/Vo), y el logaritmo de los pesos moleculares de las proteínas patrón.
* Determinar el peso molecular de una proteína problema por interpolación de su volumen de elución relativo en la gráfica anterior.
* Mencionar las ventajas y limitaciones de este métodos.FUNDAMENTO_________________________
La cromatografía por exclusión molecular es un método en el que la fase estacionara es una malla o criba molecular. Se usa en columnas abiertas con alimentación por gravedad para separaciones de preparación, y para separaciones de alta eficiencia. Estas mallas son carbohidratos poliméricos y acrilamidas que tienen una red abierta formada por el entrecruzamiento de cadenas poliméricas. Sonhidrofílicas por lo que son capaces de absorber agua e hincharse, causando la abertura de su estructura.
Las moléculas solvatadas mayores que los poros más grandes del gel hinchado no pueden penetrar en éste, por lo que atravesarán la columna por los espacios que hay entre las partículas individuales. Sin embargo, las moléculas más pequeñas sí penetrarán el área abierta en las partículas en gradovariable, lo cual dependerá de su tamaño y forma. En consecuencia, se retardarán en distintos grados y se eluirán por tamaño molecular decreciente.
El límite de exclusión es el peso molecular de moléculas que se encuentran en el límite para permear el gel y ser retardadas. Este peso puede variar desde 1000 hasta varios millones para permear el gel y ser retardadas. Se debe subrayar que lasseparaciones se basan en el tamaño y configuración de las moléculas, y no sólo en su peso molecular, aunque por lo regular están correlacionados. En general, las moléculas de tamaño por debajo del límite de exclusión se pueden fraccionar hacia abajo hasta cierto tamaño límite.

Un material muy usado en las mallas moleculares para separar proteínas es el Sephadex. Se trata de un carbohidrato poliméricoque, debido a sus grupos hidroxilo a lo largo de la cadena polimérica, es altamente polar y por lo tanto absorbe agua. La cantidad de entrecruzamiento se puede controlar con cuidado en la preparación para obtener diferentes tamaños de poro y límites de exclusión. Los geles se caracterizan de acuerdo con su capacidad de hi

DATOS EXPERIMENTALES________________

DETERMINACIÓN DEL VOLUMEN VACÍO(Vo) DE LA COLUMNA

Tabla1.-Determinación del volumen vacío (Vo) |
No. Fracción | Vol. Elución (mL) | A615 |
1 | 3 | 0 |
2 | 6 | -0.007 |
3 | 9 | -0.002 |
4 | 12 | 0.001 |
5 | 15 | 0.276 |
6 | 18 | 0.753 |
7 | 21 | 0.235 |
8 | 24 | 0.065 |
9 | 27 | 0.026 |
10 | 30 | 0.019 |
11 | 33 | 0.013 |
12 | 36 | 0.012 |
13 | 39 | 0.009 |
14 | 41 | 0.004 |
15 | 44 | 0.002 |Gráfica 1.- Perfil de elución de la dextrana azul 2000

¿Cuál fue el volumen vacío de la columna?

En la sexta fracción: 18mL (A=0.753)

1) Determinación del volumen de elución (Ve), de las proteínas patrón y problema.
Tabla 2.- Determinación del volumen de elución | |
Volumen De elución | Absorbancia | |
| Triptona | Hemoglobina | Ovoalbumina | Lisozima | Hemoglobina | |...