Cromatografía de exclusión molecular e intercambio iónico
Páginas: 18 (4305 palabras)
Publicado: 20 de enero de 2011
Universidad Central de Venezuela
Facultad de Ciencias
Escuela de Biología
Departamento de Biología Celular
Laboratorio de Bioquímica General
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR E INTERCAMBIO IÓNICO
Caracas, 15 de Diciembre de 2010
MARCO TEÓRICO
La cromatografía, es una técnica usada frecuentemente en el ámbito científico e industrial con la cual se estudian y se realizan laseparación de moléculas (formando una mezcla en una solución) basada en sus diferencias en cuanto a estructura (tamaño) y/o composición.
En General, la cromatografía es el movimiento de partículas a ser separadas por medio de un soporte al que llamaremos fase estacionaria, y que al mismo tiempo obstaculizará otras partículas de las cuales queremos separar lasprimeras(http://www.accessexcellence.org/LC/SS/chromatography_background.php, consulta 16/12/2010).
Hoy en día, la cromatografía es una técnica muy utilizada por ciencias modernas, y se basa en la utilización (en la mayoría de las veces), de los métodos de la cromatografía en columna para separar moléculas. Estos métodos cromatográficos específicos, comportan el paso de una solución a través de un medio que presenta una absorciónselectiva para los distintos componentes del soluto. La rapidez con la que pasa cada componente de la fase móvil, depende de manera inversa de la fuerza con la que esta interactúe con la fase estacionaria (LEHNINGER, A 2005).
La velocidad de elución de una sustancia en una columna cromatográfica, dependerá de que tan selectiva sea la fase estacionaria que se use en esta técnica y de qué tipo defase móvil se use para la elución de la sustancia deseada. Existen diferentes tipos de métodos cromatográficos basados en una columna de separación como lo es la filtración por gel o exclusión molecular y cromatografía de intercambio iónico entre otros (LEHNINGER, A 2005).
La cromatografía de filtración por gel, se basa en la separación de moléculas de acuerdo al tamaño de estas partículas. Se usaun gel formado molecularmente por una matriz esponjosa (esferas diminutas) que contiene poros con una distribución de tamaño relativamente restringida. Cuando una solución que está formada
Por moléculas de distintos tamaños, se hace correr por este método, las partículas de mayor tamaño, no podrán entrar en las esferas que conforman el gel, por lo que eluirán primero, ya que su recorridosólo está restringido a realizarse entre las esferas porosas y por lo tanto, dicho recorrido dentro de la columna se hace más corto, mientras que las partículas de menor tamaño, eluirán posteriormente debido a que podrán entrar en las esferas estructurantes del gel (fase estacionaria) y hacer un recorrido interno dentro de ellas. Por lo tanto, la distancia total que las moléculas de menor tamañohacen, será entonces mucho mayor que aquellas que sólo eluyen entre las esferas porosas debido a que las primeras recorren una distancia adicional dentro de las partículas que conforman el gel, como se muestra en la FIGURA: 1.A; donde las partículas rojas (las de menor tamaño) entran en las esferas porosas (esferas de color gris) que conforman el gel; y las esferas que se observan en la imagen detamaño intermedio, de color azul, son las esferas de mayor tamaño y sólo eluyen entre las esferas porosas (Unidad docente de Bioquímica, 2008).
Moléculas con un tamaño parecido o igual al del poro de la esfera, no será capaz de entrar en ella, por lo que se dice que la molécula ha sido excluida. Este gel, capaz de retener algunas moléculas se llama Sephadex ®, que consiste en el entrecruzamientode polímeros de dextranos. Existen diferentes tipos de geles según el grado de entrecruzamiento de estos polímeros, el gel usado en esta práctica fue shepadex ® G-25, que posee un rango de fraccionamiento de entre 1000 y 5000 Dalton (Unidad docente de Bioquímica, 2008).
molécula ionizada en Na+ y Cl-), eluirán aquellas moléculas que tengan carga positiva, ya que sentirán una fuerza...
Facultad de Ciencias
Escuela de Biología
Departamento de Biología Celular
Laboratorio de Bioquímica General
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR E INTERCAMBIO IÓNICO
Caracas, 15 de Diciembre de 2010
MARCO TEÓRICO
La cromatografía, es una técnica usada frecuentemente en el ámbito científico e industrial con la cual se estudian y se realizan laseparación de moléculas (formando una mezcla en una solución) basada en sus diferencias en cuanto a estructura (tamaño) y/o composición.
En General, la cromatografía es el movimiento de partículas a ser separadas por medio de un soporte al que llamaremos fase estacionaria, y que al mismo tiempo obstaculizará otras partículas de las cuales queremos separar lasprimeras(http://www.accessexcellence.org/LC/SS/chromatography_background.php, consulta 16/12/2010).
Hoy en día, la cromatografía es una técnica muy utilizada por ciencias modernas, y se basa en la utilización (en la mayoría de las veces), de los métodos de la cromatografía en columna para separar moléculas. Estos métodos cromatográficos específicos, comportan el paso de una solución a través de un medio que presenta una absorciónselectiva para los distintos componentes del soluto. La rapidez con la que pasa cada componente de la fase móvil, depende de manera inversa de la fuerza con la que esta interactúe con la fase estacionaria (LEHNINGER, A 2005).
La velocidad de elución de una sustancia en una columna cromatográfica, dependerá de que tan selectiva sea la fase estacionaria que se use en esta técnica y de qué tipo defase móvil se use para la elución de la sustancia deseada. Existen diferentes tipos de métodos cromatográficos basados en una columna de separación como lo es la filtración por gel o exclusión molecular y cromatografía de intercambio iónico entre otros (LEHNINGER, A 2005).
La cromatografía de filtración por gel, se basa en la separación de moléculas de acuerdo al tamaño de estas partículas. Se usaun gel formado molecularmente por una matriz esponjosa (esferas diminutas) que contiene poros con una distribución de tamaño relativamente restringida. Cuando una solución que está formada
Por moléculas de distintos tamaños, se hace correr por este método, las partículas de mayor tamaño, no podrán entrar en las esferas que conforman el gel, por lo que eluirán primero, ya que su recorridosólo está restringido a realizarse entre las esferas porosas y por lo tanto, dicho recorrido dentro de la columna se hace más corto, mientras que las partículas de menor tamaño, eluirán posteriormente debido a que podrán entrar en las esferas estructurantes del gel (fase estacionaria) y hacer un recorrido interno dentro de ellas. Por lo tanto, la distancia total que las moléculas de menor tamañohacen, será entonces mucho mayor que aquellas que sólo eluyen entre las esferas porosas debido a que las primeras recorren una distancia adicional dentro de las partículas que conforman el gel, como se muestra en la FIGURA: 1.A; donde las partículas rojas (las de menor tamaño) entran en las esferas porosas (esferas de color gris) que conforman el gel; y las esferas que se observan en la imagen detamaño intermedio, de color azul, son las esferas de mayor tamaño y sólo eluyen entre las esferas porosas (Unidad docente de Bioquímica, 2008).
Moléculas con un tamaño parecido o igual al del poro de la esfera, no será capaz de entrar en ella, por lo que se dice que la molécula ha sido excluida. Este gel, capaz de retener algunas moléculas se llama Sephadex ®, que consiste en el entrecruzamientode polímeros de dextranos. Existen diferentes tipos de geles según el grado de entrecruzamiento de estos polímeros, el gel usado en esta práctica fue shepadex ® G-25, que posee un rango de fraccionamiento de entre 1000 y 5000 Dalton (Unidad docente de Bioquímica, 2008).
molécula ionizada en Na+ y Cl-), eluirán aquellas moléculas que tengan carga positiva, ya que sentirán una fuerza...
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