Cromatografía De Hplc

SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN MEDIANTE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Introducción En esta práctica, se separará e identificarán los principios activos de diversos productos farmacéuticos mediante una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En este caso, se usará una cromatografía de partición. Puesto que el tamaño de las partículas oscilará entre 3 y 10 μm, será necesariousar una bomba que proporcione altas presiones. Como en toda cromatografía, se deben escoger las fases móviles adecuadas, además, la forma de trabajo será una separación en fase inversa, es decir, con las fases estacionarias no polares y las móviles polares. En nuestro caso, dicha fase móvil estará formada por una mezcla de metanol, agua y ácido acético. Las proporciones de la fase serán del 40%,59% y 1% respectivamente. Se trabajará en régimen isocrático, es decir, la composición de la fase móvil se mantendrá constante a lo largo de la cromatografía.

Sólo cuando se acaban de realizar las cromatografías se pasaría a un régimen de gradiente para limpiar el cromatógrafo (primero entraría una fase de composición H2O/Metanol al 50% y finalmente una composición de metanol. Así, en nuestrocromatrógrafo contaremos con tres fases móviles, a las que llamaremos A (metanol), B (H2O/Metanol al 50%) y C (la mezcla que constituirá nuestra fase móvil mientras trabajemos). Puesto que la fase móvil no puede tener gases, (es decir, que las columnas estén desgasificadas, se aplica vacío y presión negativa, de tal forma que el oxígeno y otros posibles gases que pudieran crear interferencias en lalectura sean expulsados. No obstante, se deberá tener especial cuidado de no introducir burbujas durante la introducción de la sustancia a leer en el inyector, pues su presencia provocará señales erráticas. Otras opciones a seguir para evitar gases serían los desgasificadores de membrana o el uso de helio, el cual desplaza al oxígeno sin interferir en la señal.

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Básicamente, podríamosdefinir los componentes básicos de un cromatógrafo con el siguiente esquema:

Tras haber definido nuestra fase móvil, se deberá fijar la fase estacionaria, que en nuestro caso será octadecilo (C18), que conformará la columna y la fase apolar de nuestro cromatógrafo:

Además de grupos silanoles. A estos grupos, mediante sus grupos alcoholes se les unirán los octadecilos, pero puesto que sonmoléculas con un gran impedimento estérico no se unirán muchas y seguirán quedando numerosos grupos OH de los silanoles. Para ello se los recubre mediante trimetilclorosilano mediante un proceso que se denomina desactivación. Estos compuestos conformarán nuestra fase apolar por la que pasará la polar en la columna.

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Para realizar la cromatografía es necesario inyectar las sustancias a muchapresión. Para ello, el cromatógrafo cuenta con un inyector, que cuenta con seis vías o conductos:

El bucle será de 20 μL, y lo que nosotros inyectemos con una jeringa será de unos 80 -100 μL. Lo que rebase al inyectar se irá por las dos vías externas hacia el exterior. Se desplazarán los 20 μL del bucle y iniciará una nueva lectura.

Fundamento de la cromatografía: El analito menos polar seráretenido durante más tiempo ( o interaccionará con mayor intensidad ) en la columna (fase apolar), de forma que los polares eluyen más rápidos al ser retenidos menos tiempo, y los menos polares, eluyen más tarde. Objetivos: Se trata de detectar y cuantificar los principios activos paracetamol, cafeína, salicilamida de cuatro productos farmacéuticos en diversos estados: Rinomicina (sólido), Apiretal(líquido), Yendol (sólido) e Ílvico (también sólido).

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Paracetamol

Cafeína

Salicilamida

Siguiendo el fundamento anteriormente expuesto, y tal como se observa en la estructura de los principios activos, el compuesto más polar será el paracetamol, seguido de la cafeína y siendo el último la salicilamida. Así, cuando observemos la señal, el primero que eluyirá será el paracetamol, y...