Cromatografía en columna

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

OBJETIVOS
*Conocer la técnica de cromatografía en columna, sus características y los factores que en ella intervienen.
*Utilizar la cromatografía en columna para la separación de mezclas de compuestos orgánicos.
*Controlar por cromatografía en capa fina la separación de una mezcla de compuestos por cromatografía en columna.

ANTECEDENTES
Cromatografía en columna:Se emplea para la separación de mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se preparamezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de ésta un poco de algodón o lana de vidrio, para evitar que la sílica o la alúmina queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel del soporte. A continuación se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogiéndose por lo general entubos de ensayo. Una columna de cromatografía es un tubo de vidrio relleno con una sustancia sólida de propiedades adsorbentes constituida por pequeñas partículas: gel de sílice y alúmina son las más usadas. Este relleno es lo que se conoce en cromatografía como la fase estacionaria. A través de la columna se hará pasar una corriente de un disolvente o mezcla de disolventes denominada eluyentey/o fase móvil. La mezcla de compuestos a separar se disuelve en una pequeña cantidad de disolvente y se coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando adsorbida por el mismo. A continuación se pasa un flujo de eluyente a través de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados por el eluyente a su paso, haciéndoles avanzar a lo largo de la columna.Sin embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es precisamente la clave de la cromatografía. Algunos compuestos se ven más fuertemente retenidos por el adsorbente (fase estacionaria) y por lo tanto avanzarán más despacio. Por el contrario, otros apenas son retenidos y avanzarán a mayor velocidad. En general se dice que la separación en la cromatografía se basa en laafinidad diferencial de los distintos compuestos por la fase móvil o la fase estacionaria.
Adsorbente y eluyentes
Son muchos los sólidos que se han utilizado como fase estacionaria en cromatografía de adsorción. Los más importantes son alúmina, silicato de aluminio, silicagel, óxido, silicato y carbonato de magnesio, óxido, carbonato y fosfato de calcio, como inorgánicos; y carbón, almidón yazúcares como orgánicos. Normalmente deben ser sometidos a un proceso térmico de activación superficial antes de su utilización. Como eluyentes se utilizan agua, alcoholes, cetonas, ésteres, cloroformo, tetracloruro de carbono, etc. Su capacidad de elución depende de su polaridad, del absorbente y de las especies a eluir.
Caracteristicas:
*Usa columnas de vidrio abiertas.
*El tamño depende de lascantidades de muestra a separar.
*Fase estacionarias > 150 μm.
*La fase móvil flue por gravedad.
Usos generales: Aplicaciones en bioquímica, especialmente exclusión molecular en gel y cromatografía de afinidad.

Mecanismo de separación:

Cromatografía de absorción: Usa frecuentemente sílica gel o alúmina como absorbentes y disolventes no polares como hexano con una pequeña cantidad de aditivopolar como isopropanol como fase móvil.

Cromatografía de partición:

Se usa un material de soporte sólido cubierto con una película de la fase estacionaria líquida, insoluble o al menos inmiscible con la fase móvil. Aprovecha la capacidad del soluto de distribuirse entre dos fases líquidas, determinado por su coeficiente de partición. Por ende, componentes de una mezcla con coeficientes de...