Cromatografía por exclusión


Determinación del Peso Molecular de una Proteína Usando Cromatografía por Exclusión Molecular.



Objetivos:
Utilizará el gel apropiado para eluir proteínas de peso molecular conocido y determinará su volumen de elución.
Realizará una gráfica que relacione los volúmenes de elución relativos (Ve/Vo), y el logaritmo de los pesos moleculares delas proteínas patrón.
Determinará el peso molecular de una proteína problema por interpolación de su volumen de elución relativo en la gráfica anterior.
Mencionará las ventajas y limitaciones del método.

Resultados experimentales.
Determinación de volumen vacío (V0)
No de fracción
Volumen de elución (mL)
A615
1
3
0
2
6
0
3
9
0
4
12
0
5
15
0
6
18
1.203
7
21
0.856
8
240.104
9
27
0.009
10
30
0
11
33
0


Al realizar el perfil de elución con dextrana azul 2000 podemos observar que la máxima absorbancia la obtuvimos en la sexta fracción que corresponda a 18 ml siendo este nuestro volumen vacío.
Determinación del volumen de elución (Ve), de las proteínas patrón y problema.
Determinación del volumen de elución
Volumen de elución (ml)
AbsorbanciaLisozima
Pepsina
Tripsina
Hemoglobina
Problema
3
0
0
0
0
0
6
0
0
0
0
0
9
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
15
0
0.191
0.002
0.411
0
18
0
0.824
0
2.053
0
21
0
0.62
0.027
1.682
0
24
0
0.47
0.335
1.355
0.005
27
0.147
0.354
0.778
0.932
0.013
30
0.59
0.395
0.803
0.578
0.05
33
1.129
0.393
0.579
0.343
0.09
36
1.293
0.365
0.359
0.192
0.09239
1.059
0.329
0.258
0.104
0.057
42
0.679
0.288
0.279
0.06
0.016
45
0.375
0.154
0.292
0.034
0
48
0.172
0.067
0.198
0.025
0
51
0.067
0.01
0.098
0.017
0
54
0.018
0
0.027
0
0
57
0
0
0
0
0
60
0
0
0
0
0
63
0
0
0
0
0
66
0
0
0
0
0

El volumen de elución (Ve) corresponde al tubo donde se haya obtenido la mayor absorbancia.

Con los datosobtenidos se realiza otra gráfica relacionando el logaritmo del peso molecular de las proteínas patrón y el volumen de elución relativo (Ve/V0).
Relación de Ve/V0 y el logaritmo del peso molecular de las proteínas patrón.
Proteína
Vo (mL)
Ve (mL)
Ve/Vo
PM
Log
Hemoglobina
18
18
1
64500
4.809559715
Lisozima
18
36
2
14400
4.158362492
Tripsina
18
30
1.66666667
24000
4.380211242Pepsina
18
18
1
34500
4.537819095
Problema
18
36
2
*14463.4884
*4.160273
*Se obtienen por la interpolación con la curva tipo corregida.


Al realizar la curva de calibración podemos observar que hay un punto que no se ajusta a la linealidad y por tanto nuestro coeficiente de correlación es bajo. Este punto corresponde al de la pepsina por lo que por motivos prácticos procederemos aeliminarlo por lo que nos queda la gráfica siguiente.

Con la ecuación de la gráfica obtenida, procedemos a interpolar utilizando el valor de volumen de elución relativo del problema.

Cálculo de cada uno de los volúmenes que componen al lecho cromatográfico:
VT= Vo+Vg+Vi
VT: Volumen que ocupa en su totalidad el lecho cromatográfico.
V0: Volumen intersticial entre las esferas del gel,ocupado por regulador.
Vg: Volumen que ocupa únicamente el gel hinchado.
Vi: Volumen ocupado por el regulador en el interior de la estructura del gel.

El volumen total se calcula midiendo el diámetro de la columna y la altura del nuestro lecho cromatográfico, realizando el cálculo como si de un cilindro se tratase:



d: Diámetro de la columna.
L: Largo del lecho cromatográfico.

Paracalcular Vi se consultan algunos datos otorgados por el proveedor del Sephadex G-75 utilizado en la práctica:



El valor anterior nos representa la masa que hay del gel en nuestra columna, para obtener el volumen utilizamos la siguiente relación:



Teniendo estos valores y con el volumen vacío obtenido anteriormente se puede calcular Vg:


Volúmenes de los lechos cromatográficos...