Cromatografía

11. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina
Jesús V. Jorrín Novo, Mª Nieves Abril Díaz, José A. Bárcena Ruiz
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que loscomponentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase móvil o eluyente (disolvente B). Es una técnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatográfico) y de fácil desarrollo. El parámetro experimental asociado a la técnica es el Rf(coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química y su hidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de ejemplo, y dentro de la presente práctica, se llevará a cabo la separación de una mezcla de aminoácidos, que se revelarán e identificarán mediante la reacción con la ninhidrina.

Palabras clave:análisis cualitativo, biomoléculas, coeficiente de reparto, reacciones coloreadas. Abreviaturas empleadas. CCF: cromatografía en capa fina; TLC: thin layer chromatography.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1. Separación de moléculas por cromatografía El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos suaislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, decambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases).

Todas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. Entre dichas propiedades podríamos citar: i) Diferencias ensolubilidad en diferentes solventes, tanto orgánicos como acuosos. ii) Diferencias en tamaño y forma. iii) Diferencias en carga. iv) Diferencias en afinidad por otras biomoléculas. Todas estas propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están influenciadas por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura, fuerza iónica e hidrofobicidad. De forma general, en las técnicascromatográficas existe una distribución de las moléculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase móvil que circula sobre la fase estacionaria en íntimo contacto con ésta. 1.2. Cromatografía de reparto En la presente práctica llevaremos a cabo una cromatografía de reparto, en capa fina, para la separación de aminoácidos. En lacromatografía de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tiendena frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción. La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas....