Cromatografia Bidimensional

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

“Verificación del funcionamiento de un espectrofotómetro”

Grupo 5QM3 Sección 2

Yong Mendoza Samantha

SEPTIEMBRE 2011

OBJETIVOS

a) Evaluar el rendimiento instrumental de un espectrofotómetro.
b) Verificar:
a. laexactitud de la escala de la longitud de onda
b. la presencia de radicación dispersa
c. el ancho de banda
d. la exactitud fotométrica
e. la proporcionalidad de respuesta y
f. el rendimiento global del instrumento.

FUNDAMENTO

La cromatografía de capa fina se basa en el principio de reparto en dos fases. En lo general, en una cromatografía, se permite que la mezclaa separar entre en contacto con una matriz, a la que llamamos fase estacionaria. La fase móvil es un segundo medio inmiscible con la fase estacionaria que se hace fluir a través de la fase estacionaria, de tal modo que gracias a las diferentes interacciones llevadas a cabo entre las moléculas, la fase móvil las arrastrará a diferentes velocidades.
En la cromatografía de capa fina, la faseestacionaria es una fina capa de material granulado (sílica gel, alumina, etc.) que es depositaba sobre una placa de vidrio, aluminio u otro material inerte. La muestra debe aplicarse hacia el extremo inferior de la placa añadiendo pequeñas gotas de la muestra. Una vez las muestras secas, la placa se sumerge en una pequeña cantidad de la fase móvil, la cual comenzará a subir por capilaridad.
En elascenso, la fase móvil va arrastrando las moléculas más apolares, dejando atrás las sustancias polares; ya que estas últimas interaccionan con la fase estacionaria que se encuentra hidratada y por lo tanto se le considera como polar.
Una ventaja de la cromatografía de capa fina, es que puede aumentarse su resolución usando la cromatografía bidimensional de capa fina; para ello se emplea una placagrande y cuadrada. La muestra se deposita en una de las esquinas inferiores y se desarrolla con dos fases móviles distintas, girando la placa 90° para poder desarrollar con la segunda fase móvil. Con frecuencia, el pH es un factor importante para lograr una adecuada separación de los analitos.
La placa desarrollada debe dejarse secar, y posteriormente se revela con un reactivo que tiña losanalitos de interés. En el caso de separación e identificación de aminoácidos puede emplearse una solución de ninhidrina para detectarlos, los aminoácidos se observan de color púrpura en un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina y la hidroxiprolina dan una coloración amarillo oscuro debido a la falta de producción de amoniaco en la reacción con la ninhidrina.

RESULTADOS
*Cromatogramas obtenidos

Figura 1. Cromatograma unidimensional de 10 soluciones tipo de aminoácidos y el problema (jugo de mango), desarrollado con una solución de cloroformo- metanol- amoníaco (2:2:1). Las manchas corresponden, de izquierda a derecha, a: los aminoácidos Thr, Arg, Lys, Phe, His, Glu, Tyr, Gly, Pro y Met; y a la mancha del problema.

Figura 2. Cromatograma unidimensional de 10soluciones tipo de aminoácidos y el problema (jugo de mango), desarrollado con una solución de cloroformo- metanol- agua- urea (4.5: 4.5: 1.0: 0.03 g). Las manchas corresponden, de izquierda a derecha, a: los aminoácidos Thr, Arg, Lys, Phe, His, Glu, Tyr, Gly, Pro y Met; y a la mancha del problema.
Punto de aplicación de muestras
Frente del solvente 2
Frente del solvente 1
10
9
8
7
6
5
43
2
1

Figura 3. Cromatograma bidimensional de 10 soluciones tipo de aminoácidos (Thr, Arg, Lys, Phe, His, Glu, Tyr, Gly, Pro y Met). Se empleo como primer fase móvil una solución de cloroformo- metanol- amoníaco (2: 2:1) y como segunda fase móvil una solución cloroformo- metanol- agua- urea (4.5: 4.5: 1.0: 0.03 g).

Figura 4. Cromatograma bidimensional del problema (jugo de mango). Se...