Cromatografia De Capa Delgada Para Aminoacidos

1. Práctica III: Separación de Extractos vegetales por cromatografía en capa delgada.
2. Objetivos:
* Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de
sílice.
* Revelado de los aminoácidos mediante la reacción coloreada con la
ninhidrina.
* Cálculo del valor de Rf para cada uno de los aminoácidos. Justificación de
las diferencias en Rf de los distintosaminoácidos.
* Identificación de la naturaleza de aminoácidos desconocidos.

3. Fundamento teórico
Cromatografía en Capa Fina:
La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria (disolventeA), y fase móvil o eluyente (disolvente B). Es una técnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatográfico) y de fácil desarrollo. El parámetro experimental asociado a la técnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química y suhidrosolubilidad/liposolubilidad. A modo de ejemplo, y dentro de la presente práctica, se llevará a cabo la separación de una mezcla de aminoácidos, que se revelarán e identificarán mediante la reacción con la ninhidrina.
En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en la terminología inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finasy distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm deespesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarsesecar antes de su utilización.
Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico ya que va a afectar a la resolución (separación de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del compuestoo compuestos de interés en la muestra. Para soluciones concentradas bastará una cantidad muy pequeña (rango de µl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutosde interés. En este caso conviene hacer la aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicación se haría muy grande, distando mucho de la situación ideal de concentración de la muestra en un solo punto de aplicación). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduceen un recipiente cerrado (tanque cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con...