Cromatografia

14. Cromatografía de filtración en gel de sangre de vaca y cerdo: formas redox de la hemoglobina
Concepción García Alfonso, Jose Antonio Bárcena Ruiz, Jesús Díez Dapena, Emilia Martínez Galisteo, C. Alicia Padilla Peña
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

La hemoglobina (Hb) transporta el oxígenodesde los pulmones, agallas o piel (dependiendo de la especie animal) hasta los tejidos. También transporta desechos del metabolismo desde los tejidos hasta los pulmones para eliminarlos. Existen distintas clases de Hb, oxihemoglobina, en forma reducida (Fe2+) de color rojo, unida al oxígeno y metahemoglobina, forma oxidada (Fe3+) incapaz de unirse al oxígeno y de color pardo. En esta práctica seaprenderá a manejar la técnica de cromatografía por filtración en gel, aprovechando las características diferentes de estas dos formas de Hb. En ella, la Hb oxidada (metahemoglobina) la separaremos de su oxidante artificial, reduciéndola a oxihemoglobina. Asimismo, se determinarán los espectros de absorción de las dos formas de hemoglobina citadas. Palabras clave: desoxihemoglobina,metahemoglobina, oxihemoglobina. Abreviaturas empleadas. CN-met-Hb: cianometahemoglobina; EDTA: ácido etilén diamino tetraacético; Hb: hemoglobina; met-Hb: metahemoglobina; (oxid): oxidado; (red): reducido

1. INTRODUCCIÓN La sangre es un tejido orgánico en forma de líquido viscoso, de color rojizo, e integrado por elementos celulares libres (células sanguíneas) y por una sustancia fundamental líquida(plasma). De las células sanguíneas las que nos interesan son los eritrocitos, células anucleadas en forma de disco circular bicóncavo y superficie lisa, que contienen un 33% de hemoglobina. La hemoglobina es la molécula encargada de transportar el oxígeno a cada una de las células del organismo, por lo que juega un papel vital en el aspecto más importante del metabolismo, ya que los mecanismos máseficientes para generar energía en las células animales, requieren oxígeno molecular para la oxidación de los alimentos. También transporta una parte del CO2 producido en los tejidos hasta los pulmones. La hemoglobina es una proteína, con un peso molecular de 66.000 d. Está formada por 4 cadenas polipeptídicas, cada una unida a un grupo hemo. Éste está formado por una porfirina unida a Fe que puedeestar en forma oxidada (Fe3+) o en forma reducida (Fe2+). La forma
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reducida es la única capaz de unirse al O2 y se denomina oxihemoglobina cuando está unida al O2 (de color rojo vivo, es la que se encuentra en la sangre arterial). La sangre venosa (rojo oscuro) contiene bastante desoxihemoglobina, que no contiene oxígeno y sí CO2 unido como carbamino-Hb. El átomo de hierro del grupo hemo semantiene en todas estas formas en su forma reducida Fe2+. Si se oxida a Fe3+ es incapaz de unirse al O2 ni al CO2 y se denomina metahemoglobina (de color pardo). 1.1. OBJETIVOS • Comprender el mecanismo de la cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel. • Observar las diferentes formas redox de la hemoglobina y sus diferentes espectros de absorción

1ª Parte FILTRACIÓN EN GEL DEHEMOGLOBINA
1.- FUNDAMENTO La cromatografía de filtración en gel o exclusión molecular, una de las modalidades de cromatografía en gel, es un proceso en que los componentes de una muestra se separan en función de su tamaño y su forma molecular. La separación se realiza en una columna que contiene un gel formado por bolitas porosas compuestas de un polímero insoluble, pero altamente hidratado, talescomo el dextrano y la agarosa (carbohidratos) o la poliacrilamida. Sephadex, Sepharosa y Biogel son preparaciones comerciales de estas bolitas usadas normalmente. Los componentes a separar se establecen entre el disolvente que fluye por el exterior de estas bolitas (fase móvil) y el que se encuentra en el interior de las mismas (fase estacionaria). Las variables que determinan la distribución de...