Cromatografia

PRACTICA Nº2
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

OBJETIVO.-
* Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, sus características y los factores que en ella intervienen.
* Calcular valores de Rf de varias sustancias.
* Aplicar la técnica de cromatografía en capa fina como criterio de pureza de las sustancias.

FUNADAMENTO TEORICO.-
La cromatografía en capa fina es un caso decromatografía de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase móvil o eluyente (disolvente B).

Es una técnica simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatográfico) y de fácil desarrollo. El parámetroexperimental asociado a la técnica es el Rf (coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto entre la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química y su hidrosolubilidad/liposolubilidad.

Separación de moléculas por cromatografía

El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.)requiere en numerosos casos su aislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación(cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases).

Todas las técnicas intentan explotar las diferencias físicas, químicas y biológicas de las distintas biomoléculas para llevar a cabo su separación y aislamiento. Entre dichas propiedadespodríamos citar:

i) Diferencias en solubilidad en diferentes solventes, tanto orgánicos como acuosos.
ii) Diferencias en tamaño y forma.
iii) Diferencias en carga.
iv) Diferencias en afinidad por otras biomoléculas.

Todas estas propiedades y, por tanto, la separación de diferentes compuestos están influenciadas por las condiciones del medio de separación, pH, temperatura, fuerzaiónica e hidrofobicidad.

De forma general, en las técnicas cromatográficas existe una distribución de las moléculas entre dos fases, la fase estacionaria o parte del sistema separador que permanece fija en el espacio, y la fase móvil que circula sobre la fase estacionaria en íntimo contacto con ésta.

En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, en laterminología inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestosno polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formadapor la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilización.
Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la resolución...