Cromatografia

Cromatografía de líquidos de alta eficiencia.

Es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica. También se la denomina a veces Cromatografía líquida de alta presión oHigh pressure liquid chromatography (HPLC), aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso. El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de unamezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.

Una mejora introducida a la técnica de HPLC descrita es la variación en la composición de la fase móvil durante el análisis, conocida comoelución en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de formalineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos más hidrofílicos eluirán a mayorconcentración de agua, mientras que los compuestos más hidrofóbicos eluirán a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de optimizar el gradiente de forma que permita una buena separación de los compuestos.

Eficacia de la columna en la cromatografía de líquidos
Los principales factores que afectan la eficiencia de la cromatografía liquidason el efecto del tamaño de partícula del relleno, ensanchamiento de banda extracolumna y efecto del tamaño de muestra.
* Efecto del tamaño de la partícula de relleno: este esta relacionado directamente con el diámetro de la partícula que constituye el relleno, como consecuencia de esto la eficacia de la columna, debería mejorar excelentemente cuando se disminuye el tamaño de la partícula.* Ensanchamiento de banda extracolumna: en cromatografía de líquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna propiamente dicho. El así llamado ensanchamiento de banda extra-columna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los detectores y en los tubos queconectan los distintos componentes del sistema.

* Efecto del tamaño de muestra: La cantidad de muestra (g de muestra/g de relleno) también afecta a la eficacia de la columna. Para las aplicaciones con columnas de reparto y adsorción, la eficacia decrece notablemente con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es mucho más pequeño.

Teóricamente sueleconsiderarse que la muestra se introduce en el sistema cromatográfico de forma que ocupa una capa de espesor infinitamente pequeño. Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa un volumen finito, y a veces relativamente grande, tal como sucede en CG, donde un micro-litro de una sustancia líquida inyectada puede ocupar un volumen del orden de 0.5 mL cuando se vaporiza a 250 º, y ello representa varioscentímetros de longitud de columna.
Además, la lenta velocidad de vaporización contribuye también al ensanchamiento de la banda.
En cromatografía líquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado volumen de muestra a temperatura ambiente. En estas ocasiones, la relativamente lenta eliminación de trazas de la muestra de las paredes de la válvula es el factor que puede contribuir alensanchamiento de la zona

Cromatografía de adsorción.

La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la primera la preferida.
Es adecuada para...