Cromatografia

Cromatografía en Columna
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
1.- FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido porpartículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su
paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rápidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que son excluidos del gel. Deesta forma, las moléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden decreciente de peso molecular.

Se definen los siguientes parámetros:
Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel como los valores extremos
(máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
Volumen de elución es el volumen necesario para eluir un compuesto deuna columna.
Volumen de exclusión de la columna al volumen al que eluyen las moléculas de tamaño
superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partículas de gel.

1.2. - MATERIALES PARA LA FILTRACIÓN EN GEL
Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles utilizados como tamiz molecular sonpolímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan hasta formar una red tridimensional.
Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida.
Filtración en gel

La cromatografía de filtración en gel, más corrientemente llamada de exclusión molecular, es una técnica de purificación muy extendida y apreciada debido a su sencillez yeficacia en la resolución de mezclas complejas de macromoléculas. Esta técnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analíticos (por ejemplo, para la determinación de pesos moleculares).



Principio de la cromatografía de filtración en gel
Con la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas en virtud de sus diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuyamatriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre sí por enlaces químicos para formar una red tridimensional.
El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio quedando listo para su uso.
En el interior de una columna de cromatografía pueden distinguirse variosvolúmenes:
a) El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado.
b) El volumen de vacío (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel.
c) El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo.

Cuando una mezcla de moléculas de diferentes tamaños se hace pasar a través de la columna de gel,se produce la separación en virtud del siguiente principio:

- Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen total (Vt). Sin embargo, aquellas moléculas cuyo tamaño es mayor que el de los poros de las esferas delgel, no pueden penetrar en su interior y atraviesan la columna recorriendo únicamente el volumen vacío (Vo), siendo las primeras en salir de la columna. El resto de las moléculas, de tamaño intermedio, presentan una mayor o menor facilidad para difundir al interior de las esferas en función de su tamaño, siendo extraídas fraccionada mente con volúmenes que están comprendidos entre el Vt y el Vo....