Cromatografias

7- TECNICAS DE SEPARACION DE AMINOACIDOS Y PEPTIDOS

CROMATOGRAFIAS

Los métodos cromatográficos pueden aplicarse no solamente a la separación, identificación y análisis cuantitativo de mezclas de aminoácidos, sino también de pépticos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, lípidos e hidratos de carbono.
En todas las separaciones cromatografías, las moléculas son separadas dentro de unafase estacionaria y una móvil. La separación depende de la tendencia de las moléculas en la mezcla para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Para este tipo de cromatografía, se coloca una gota de solución que contenga uno o mas aminoácidos a unos 5cm del borde de una tira de papel filtro, la tira se coloca en un vaso cerrado donde su extremo entra encontacto con un solvente generalmente un alcohol de bajo peso molecular en solución saturada con agua que contiene un ácido o una base. Después de la migración del solvente sobre el papel, se seca la tira, se trata con ninhidrina en acetona y se calienta un poco, entonces las posiciones de los aminoácidos aparecen como puntos de color púrpura.

Los aminoácidos con grandes cadenas laterales no polaresemigran más que los que tienen cadenas laterales más cortas no polares o cadenas laterales polares. Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las moléculas polares en la fase estacionaria hidrófila y de las moléculas no polares en solventes orgánicos.

Para una serie no polar (Gli, Ala, Val, Leu) a mayor longitud de la cadena lateral no polar se incrementa su carácter no polar, lo cualincrementa su movilidad.

La relación entre la distancia recorrida por una aminoácido con la distancia que viaja el solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicación de la mezcla de aminoácidos, se designa como valor Rf (movilidad relativa con el solvente) de ese aminoácido.

Rf = Distancia corrida por la muestra
Distancia solvente

Los valores Rf para unaminoácido dado varían de acuerdo con las condiciones experimentales, por ejemplo según el solvente usado. Aunque es posible identificar tentativamente un aminoácido solo por su valor Rf, es preferible hacer la cromatografía estándar de aminoácidos conocidos de manera simultánea con la mezcla desconocida. Luego la movilidad puede expresarse en relación a la de un estándar.

Las movilidades expresadas comorelativas a un estándar varían menos que los valores Rf de un experimento a otro.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

Hay dos tipos distintos en cromatografía en capa fina.
-Cromatografía en capa fina por partición. CCFP
-Cromatografía en capa fina de Absorción CCFA

En la CCFP, la resolución implica partición de los elementos de una mezcla entre 2 fases liquidas, una estacionaria y otra móvilde polaridad diferente, conforma la fase móvil pasa sobre la estacionaria. La separación se produce por la diferencia de solubilidad de los componentes en las fases estacionaria y móvil.

En la CCFP normal, la fase estacionaria es el componente más polar. El solvente contiene ambos elementos: polares y débilmente no polares, agua, un alcohol de 4 o 5 carbonos un ácido débil como ácido acético ouna base débil como amoniaco.

Conforme se desplaza, el solvente cambia de composición debido a los electos mas polares que acompañan a los grupos OH polares de la celulosa. Por tanto el solvente que avanza paulatinamente se convierte en más no polar.

Los componentes no polares de una mezcla, se desplazan más lejos que los componentes polares de mismo tamaño. Ej. El glutamato y lisina seretardan, la leucina y la valina migran junto con el solvente.
La CCFP en “fase de reversa” tanto las polaridades de las fases como las movilidades de los componentes de la mezcla se revierten respecto a la CCFP normal. La fase móvil suministra la fase polar, la fase estacionaria por lo común celulosa cubierta con un liquido no polar como el aceite de silicón, suministra la fase mas no polar.

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