“Cromatografía De Exclusión Molecular E Intercambio Iónico”

Informe de Bioquímica Experimental n°4:


“Cromatografía de Exclusión Molecular e Intercambio Iónico”

Introducción:

El presente trabajo tiene como objetivo, comprender la importancia del estudio de las diferentes técnicas cromatográficas. La cromatografía, técnica más desarrollada en los últimos años empleada en la química analítica, es un método físico de separación para lacaracterización de mezclas complejas.

Mijaíl Tswett, botánico ruso, en 1906 descubrió mediante un experimento lo que se conoce como cromatografía. Tal experimento consistió en colocar un extracto de pigmentos vegetales en la parte superior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio. Al agregar éter, se observó que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas quedescendían a través de la columna a diferentes velocidades, la separación se obtuvo debido a que cada uno de los pigmentos vegetales tenía una afinidad diferente por las fases estacionarias y móviles. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso deun detector, su caracterización química.

La cromatografía tiene como característica principal la presencia de dos fases, la Fase Estacionaria que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) y la Fase Móvil que consiste en un sólido o un liquido fijado en un sólido. Ambas fases están dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (loscomponentes más afines a esta fase avanzan lentamente), la otra se desplaza a lo largo de él (los componentes más afines avanzan con más rapidez), cuya velocidad con la que se mueve cada sustancia, es clave en la separación.

Las técnicas cromatográficas son muy variadas, y pueden clasificarse según diferentes criterios, tales como el mecanismo de separación:


Objetivo



• Separar una mezclaque contiene citocromo c y dinitrofenilglicina utilizando el método de cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de intercambio iónico, métodos fundamentados en las propiedades y características de las proteínas.


Materiales




• Pinzas

• Soporte Universal

• Mariposa

• Resina Carboximetil Sephadex

• Resina DEAE Sephadex

• Tampón fosfato0,01 M pH 5

• Tampón fosfato KCl 0,01 pH 5

• Muestra Problema

• Columna de vidrio

• Manguera



Metodología



Colocar la columna en forma vertical en el soporte y posteriormente un recipiente adecuado debajo. Colocar en el fondo un círculo de papel filtro y mojar levemente con tampón fosfato. Luego agregar resina a la columna hasta llenar un 75%aproximadamente. Abrir la llave y dejar gotear, posteriormente seguir llenando, tratando de no perturbar la superficie o resina que ya está depositada dentro de la columna. Continuar agregando resina hasta obtener una columna empacada uniformemente (sin burbujas ni quiebres).

Una vez alcanzado el volumen de resina, colocar un volumen de 0,5 – 1,0 ml de la MP que se desea separar. Luego de que hay ingresadotoda la mezcla a la resina, adicionar tampón a esta y eluir los componentes agregando el tampón en forma continua, cuidando que la resina esté siempre en contacto directo con el líquido de elución.

Recoger el líquido eluído a través de la columna, en tubos de ensayo distintos para cada componente de la mezcla.



Resultados



|Orden de elución |Volumen deelución (mL) |
|Dinitrofenilglicina |6,8 mL |
|Citocromo c |No se logró medir |


Tabla 1: Orden de elución y volumen de elución dedinitrofenilglicina y citocromo C en CM-sephadex.


|Orden de elución |Volumen de elución...