Cromatografía De Filtración En Gel

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
1.- FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido
que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase
estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está
constituido por partículas esféricas quetienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de
pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su
paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello
eluyen rapidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que son excluidos
del gel. De esta forma, lasmoléculas se separan en función de su tamaño, eluyendo en orden
decreciente de peso molecular.
Se definen los siguientes parámetros:
Intervalo de fraccionamiento de un determinado tipo de gel como los valores extremos
(máximo y mínimo) de pesos moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
Volumen de elución es el volumen necesario para eluir un compuesto de una columna.
Volumen deexclusión de la columna al volumen al que eluyen las moléculas de tamaño
superior al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde a la suma del volumen de los huecos
entre las partículas de gel.
1.2. - MATERIALES PARA LA FILTRACIÓN EN GEL
Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles utilizados
como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos einsolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan
hasta formar una red tridimensional.
Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta
práctica se utilizará el gel dextrano.
El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas
bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según eltamaño de poro,
proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican
por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del
gel multiplicada por 10. 1.3.
- APLICACIONES DE LA FILTRACIÓN EN GEL
Además de utilizarse para la separación de sustancias de distintos pesos moleculares o para lapurificación de proteínas, se emplea para la determinación de pesos moleculares de proteínas.
Para una gran variedad de tipos de geles se ha comprobado que existe una relación lineal entre el
volumen de elución y el logaritmo del peso molecular de las proteínas. Por lo tanto, es suficiente medir
el volumen de elución de una proteína desconocida para llevarlo a una recta de calibrado (preparada
conproteínas puras de peso molecular conocido) y deducir aproximadamente su peso molecular.
SEPARACIÓN DE LAS DISTINTAS FORMAS DE OXIGENACIÓN DE LA HEMOGLOBINA
En esta práctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25 (dextrano de alto
entrecruzamiento, pequeño tamaño de poro), aprovechándose la diferente velocidad de avance de la
hemoglobina frente a los reactivos de pequeño tamaño (ferricianuroy ditionito).
El ferricianuro (Fe[CN]63-) es un agente oxidante, capaz de oxidar el Fe2+ de la oxihemoglobina
(rojo vivo) a Fe 3+, transformándose en ferrocianuro Fe(CN)64- (amarillo). Esta forma de la hemoglobina
se denomina metahemoglobina (marrón). El ditionito (S2O42-) es un agente reductor, capaz de reducir
el Fe3+ de la metahemoglobina a Fe2+. A esta forma de la hemoglobina se ledenomina
desoxihemoglobina (rojo pardo). La desoxihemoglobina capta el oxígeno disuelto en el tampón
transformándose en oxihemoglobina (rojo vivo).
Se aplicará a nuestra columna de sephadex G-25 una disolución de ditionito sódico y
posteriormente una muestra de metahemoglobina observándose una serie de bandas en función de las
reacciones que tienen lugar.
2. - MATERIAL Y REACTIVOS
Material...