Cromatografía de líquidos

4. Cromatografía de líquidos de alta resolución

Cuando se utilizan columnas de pequeño diámetro, el ensanchamiento
extracolumna puede hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han
de orientarse a la reducción del radio de los tubos del sistema externos a la columna.
Efecto del tamaño de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra
(µg de muestra/g derelleno) también afecta a la eficacia de la columna. Para las
aplicaciones con columnas de reparto y adsorción, la eficacia decrece notablemente con
la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es
mucho mas pequeño.

4.1. INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño
de partículaentre 3 y 10 µm, que, por otra parte, son comunes en la moderna
cromatografia de líquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por
centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo
necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros
tipos de cromatografia. La Figura 4.2 muestra un esquema de los componentesfundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico. Cada uno de los
componentes se trata en los párrafos que siguen a continuación.

Figura 4.2. Esquema de un aparato de HPLC

4.4

4. Cromatografía de líquidos de alta resolución

4.1.1. Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los
disolventes
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o másrecipientes de vidrio o
de acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los
recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos -en
general oxígeno y nitrógeno- que interfieren formando burbujas en los sistemas de
detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, un
sistema de destilación, dispositivospara calentar y agitar los disolventes o, como se
muestra en la Figura 4.2, sistemas de difusión que permiten arrastrar los gases disueltos
fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Con
frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y
de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. No es necesario quelos
desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se
muestra en la Figura 4.2. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes
antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través
de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la
materia en suspensión.
Una separación queutiliza un solo disolvente de composición constante se
denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se
aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a
veces más) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza
la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a vecescontinuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los instrumentos en
la moderna HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que permiten
introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una
velocidad que varía continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede
modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
La Figura 4.3ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de
una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática con
metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gradiente, que se inicia
con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concentración de
metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con gradiente acorta...