Cromatografía, Química bioanalítica

TEMA 7: CROMATOGRAFÍA
Es el método de separación más eficiente después de las instrumentales.
Elementos comunes en la cromatografía de columna:
a) Fase estacionaria: material sólido, polímero poroso con centros de interacción.
b) Fase móvil: disolución que atraviesa la columna interaccionando con la fase
estacionaria. Puede contener analitos, que se irán separando a distinta velocidad,eluirán
en orden según su afinidad por las dos fases. Cada una de las fracciones eluidas se
llevan a técnicas más específicas para su identificación.
c) Eluyente: disolución que atraviesa la columna. Se pueden hacer medidas “en línea” del
eluyente, típicamente colorimétricas, y a continuación recoger fracciones en viales
independientes.

7.1. Cromatografía de exclusión por tamaño.
La faseestacionaria está compuesta por partículas porosas sin interacción específica con las
partículas, excepto la debida al tamaño del poro. En general, las partículas del sólido son neutras
y poseen pocas interacciones específicas con las partículas que eluyen.
Cuando se introduce la mezcla con distinto tamaño de partículas, las partículas difunden por
efecto de la gravedad a distinta velocidad según sutamaño. Las partículas grandes eluyen con
más facilidad por lo que llegarán más rápido al fondo de la columna, mientras que las partículas
más pequeñas tardan más en eluir. Esto es debido a que las partículas pequeñas se introducen
entre los poros de la fase estacionaria, por lo que les lleva más tiempo llegar hasta abajo.
La fase sólida se compone de esferas unidas entre sí porinteracciones. Por tanto, los parámetros
importantes son el tamaño de las esferas sólidas y el tamaño del poro. El tamaño del poro
determinará un umbral de exclusión, de manera que todas las partículas que no interesan tendrán
un tamaño mayor al del poro, para que eluyan más rápido, ya que lo que interesa es separar las
de tamaño menor. El tamaño de la esfera determina la compactación de la fase sólida.Cuanto
más pequeñas sean las esferas, se deberá ejercer mayor presión para disminuir los tiempos de
retención en la fase sólida, aunque la separación es más específica y eficiente. Sin embargo, si el
tamaño de la esfera es menor, entonces habrá más espacio entre ellas y la elución será más fácil
aunque menos específica.
El coeficiente de reparto es una
magnitud física que está relacionada
conel tiempo de elución de un analito
y depende del volumen accesible a
cada uno de los analitos, que depende
a su vez del tamaño de cada analito.
Cuanto más pequeño sea el analito,
mayor volumen accesible tendrá ya
que podrá realizar el recorrido
atravesando los poros de la matriz
sólida. De esta manera, el coeficiente
de reparto para dichos analitos serán
cercanos a 1, mientras queanalitos

más grandes tendrán un coeficiente mucho menor que 1. El coeficiente de reparto se calculará
midiendo los tiempos de elución de los distintos analitos y el tiempo de elución del analito más
grande.
La fase estacionaria porosa debe tener las siguientes características:
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Neutro eléctricamente.
Hidrofílico: la fase móvil debe impregnar los poros de la fase sólidapara que los
analitos pueden penetrar entre los poros (los analitos se encuentran disueltos en la fase
acuosa).
Amplio rango de pH de trabajo.
Amplio rango de temperatura de trabajo.
Tolerante a detergentes y agentes desnaturalizantes, reductores, etc.
Esterilizable en buffers bioquímicos a 120ºC/30min.

Los materiales más habituales para la fase sólida son:
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Polisacáridos:celulosa, dextrano, agarosa.
Polímeros orgánicos sintéticos: poliacrilamida, polimetacrilato, poliestireno.
Polímeros inorgánicos: sílica.

El tamaño de partícula (esfera) oscila desde 2 micras (se usa en una separación de alta
resolución, aunque el tiempo de separación es mucho mayor) hasta 200 micras (separación
preparativa de menor resolución, el tiempo del proceso es menor).
El tamaño del...