Cromatografía

Separación cromatográfica de pigmentos
Práctica 10
Operaciones Básicas de Laboratorio I

Universidad de Alicante

Índice.
Objetivos
Proceso experimental
Resultados
Discusión
Cuestiones
Conclusiones
Bibliografía
Objetivos.

En esta práctica, pretendemos extraer los diferentes pigmentos vegetales (β-caroteno y clorofilas) de la espinaca deshidratada mediante la separacióncromatográfica en columna por gravedad (extracción sólido-líquido), por lo que intentaremos aprender a utilizar de manera correcta esta técnica. Además, cuantificaremos la cantidad de clorofila presente en las hojas de dicho vegetal mediante espectrofotometría.
Por otro lado, aprenderemos la técnica de cromatografía de capa fina, en la cual podremos observar la distinta afinidad de los pigmentoscolocados sobre la placa cromatográfica, y así poder calcular (con los datos necesarios medidos durante el proceso experimental) el parámetro inverso al tiempo de retención.
Proceso experimental.
La cromatografía es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuya finalidad es la separación de los distintos componentes de una mezcla, permitiendo de este modo la determinaciónde las cantidades de dichos componentes.
Las diferencias entres los coeficientes de partición de los compuestos dan como resultado diferencias sobre la fase estacionaria (sustancia que permanece fija e inmóvil durante el procedimiento de la cromatografía. Ejemplo: gel de sílice), y por lo tanto una separación en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla, el cual varíadependiendo de la naturaleza de ésta.
Las funciones básicas y principales de la cromatografía son la separación de componentes de una mezcla, de manera que se obtengan sustancias más puras que las iniciales para su posterior uso. Además la cromatografía tiene como finalidad el análisis cualitativo y cuantitativo de éstas.
En cuanto a las técnicas cromatográficas purificadoras, podemos destacar lacromatografía en columna con sus diferentes variables (de adsorción, en fase reversa, de permeación en gel y de intercambio iónico). En cuanto al análisis , las técnicas más utilizadas son la cromatografía de gases, la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía en capa fina. Todas estas técnicas cromatográficas se basan en las distintas afinidades de los componentes deanalito por un medio móvil (gas o líquido) y una fase estacionaria a través de la cual circulan.

La primera parte de la práctica consistirá en realizar la cromatografía de adsorción por gravedad. Para ello, hemos pesado 5,004±0,001g de hojas deshidratadas de espinaca. Preparamos una disolución constituida por 30,0±0,1ml de éter y 8,0±0,1 ml de cetona. Colocamos tanto las hojas de espinaca pesadasy la disolución en un mortero, donde mezclaremos los componentes y los trituraremos hasta obtener una masa más o menos homogénea, que será decantada en un vaso de precipitados (evitando que las hojas más grandes que se han quedado sin triturar se depositen en él).
Por otro lado se preparará el tubo en el que se va a llevar a cabo esta cromatografía: Pesamos 9,01±0,01g desílice (fase estacionaria) y prepararemos la columna utilizando como disolvente una mezcla de acetona-éter constituida por 5,0±0,1ml de acetona y 50,0±0,1ml de éter.
Vertimos el disolvente por la columna, hasta que ocupe aproximadamente 15 cm de ésta, y a continuación depositamos la sílice poco a poco (se va depositando por su propio peso sobre el fondo), repartiéndolo de forma homogénea yayudándonos de una varilla sin que queden huecos de aire, ya que podrían afectar al resultado de la práctica.
El siguiente paso, una vez que tenemos preparada la columna, es echar un poco de arena que quedará depositada sobre la superficie de sílice (unos 2 ó 3 mm de altura).

A continuación, abrimos la llave hasta que el nivel del disolvente alcance justo al superficie del nivel de arena colocado...