cromografia

 
 
 
 
 
 
 

Laboratorio de Bioquímica Práctico 7
Cromatografía

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Introducción
Para  estudiar  una  proteína  es  necesario  separarla  de  las  otras  miles  de  proteínas  que  contienen  las 
células, para ello existen diferentes técnicas. 
En  este  práctico  se   utilizará  la  cromatografía,  que  separa  componentes  individuales  a partir de mezclas 
complejas. Existen diferentes tipos de cromatografías, pero nos enfocaremos en dos de ellas. 
●       Cromatografía en capa fina 
Permite  la  separación  de  componentes  de  una  mezcla  por  la  diferente  retención  que  experimenta cada 
componente,  al  ser  más  o  menos  absorbidos  por  una  fase  estacionaria  al  ser  arrastrados  por  un 
solvente.  El  adsorbente (fase  estacionaria)  con  un  adhesivo  se  pone  sobre  una  lámina  haciendo  de 
soporte  inerte  de  la  capa.  Para  tener  una  buena  separación  se  debe  tener en cuenta las polaridades de 
las  sustancia  a  arrastrar  y  el  solvente. Dicho solvente debe estar  en una cámara cromatografía y al estar 
en  contacto  con  la  placa  cromatográfica,hacienda  y  arrastra  las diferentes sustancias según la mayor o 
menor retención que presenten. 
Con  esta  técnica  obtenemos  el  Rf  de  la  sustancia:  Rf=d/h,  donde  d  es  la  distancia  recorrida   por  la 
sustancia  y  h  es  la  altura  máxima  a la que llega el disolvente (desde el origen del sembrado). Esto es útil 
ya  el  Rf  es  característico  para  cada  compuesto, pudiendo cambiar según el disolvente que se ocupe, lo 
que ayuda a caracterizar de mejor manera dicho compuesto. 
● Cromatografía por filtración en gel (cromatografía de exclusión) 
Es  un  tipo  de  cromatografía  en  columna  que  separa  según  tamaño,  donde  la  fase  estacionaria  se 
compone  por  partículas  esféricas  microscópicas  de  un  polímero  (gel).  El  interior  de  las  esferas  está 
atravesado  por  canales  de diámetros  definidos.  Al  cargar   la  muestra  de  proteínas  en  la  parte  superior  
de  la  columna  y  al  añadir  la  fase  móvil,  las  moléculas  grandes  pasan  rápidamente  entre  las  esperas del 
polímero,  en  tanto  las  de  menor  tamaño  en  los  canales  de  las  esferas  haciendo  que  bajen  más  lento. 
Pudiendo recolectar las diferentes fracciones eluidas. 
  
 
 
 
  
 
 
 
 
 
 
 
 

Objetivos 
 
●  Separar pigmentos foliares por cromatografía en capa fina 
● Separar componentes de una mezcla por cromatografía de exclusión 
  
Materiales 
 
● Hojas de espinaca 
●   Acetona 
● Placa de capa fina de aluminio 
● Micropipeta 
● Cámara cromatográfica 
● Diclorometano 
● Columna con resina 
●  Buffer 
● Tubos de ensayo 
  Procedimiento 
 
●  Extracción de pigmentos fotosintéticos por CCP 
Se  maceran  hojas  sin  venas  con  acetona,  luego  se  filtró  en  gasa.  En  la  placa  cromatográfica  se  marcó 
una  línea  como  guía, donde se aplicó una cantidad del extracto, se  dejó secar y se repitió el proceso 20 
veces.  Luego  se  colocó  la  placa  en  la  cámara   de  cromatografía  preparada  previamente  con diclorometano. Después de algunos minutos se sacó la placa y secó a temperatura ambiente. 
  
●  Cromatografía de exclusión 
Se  nos  proporcionó  un  tubo  con  un  gel  de  exclusión  preparado  más  la  muestra  en  un  tubo  eppendorf 
luego  se  procedió  a  colocar  la muestra delicadamente sobre la columna de exclusión. En una gradilla se 
pusieron  6  tubos  de  ensayo,  cada  8 gotas  que  caían  desde  la  columna  se  cambiaba  de  tubo.  Cada 
cierto  tiempo  se  le  echaba  buffer  a  la  columna  procurando  que  no  se secara. De las  6 muestras en los 
tubos se escogieron las 2 más representativas. 
  
  
  
  
  
  
  
  

  
  
  
Resultados 
 
    Cromatografía capa fina 
 
 

                                    

 

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