Cuantificación de proteínas

Introducción

Las proteínas son unas de las biomoléculas más importante para el funcionamiento de los seres vivos. Estas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las más versátiles y diversas del organismo ya que realizan una enorme cantidad de funciones como inmunológica, enzimática, defensiva etc. Estas están compuestas por aminoácidos y se sintetizan principalmente dependiendo decómo se encuentren regulados los genes que las codifican, por lo tanto son susceptibles a señales o factores externos.
En general, no hay un método completamente satisfactorio para medir la concentración de proteínas en una muestra ya que la mayoría de sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen color. La elección del método depende de la naturaleza de la proteína, de los otros componentesde la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad deseada. Entre los métodos más comunes y efectivos para realizar la cuantificación se encuentra el método de Biuret, Lowry y Bradford los cuales utilizan la colorización de las muestras la cuantificación.
Todos estos métodos se basan en la comparación de la absorbancia de una solución la cual es medida con un espectrofotómetro. Esto se realizacomparando una solución de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya concentración se conoce y que se denomina blanco. La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que absorben también a esa longitud de onda los que se denominaninterferencias y que pueden variar el resultado final del análisis. [1]
A partir de las medidas de absorvancias versus concentracion obtenidas se debe generar un grafico que demuestre una linea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero.
El que usaremos en este laboratorio es el método de Biuret, ya que como decíamos anteriormente es más efectivo que otros para podercolorear las sustancias.
Este método se refiere a la presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares deelectrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea (H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus moléculas.
A mayor concentración de proteínas, mayor intensidad decolor violeta. Estas reacciones, en las que el color formado es proporcional a la cantidad de sustancia se llaman reacciones colorimétricas. [2]




Datos experimentales:


Tabla Principal


TUBO
BSA
(uL)
H2O
(uL) R. BIURET Abs Concentration
10 mg/mL MP (mL)
1 B 0,0 --- 1,0 3,0 Blanco
2 S 100 --- 900 3,0 0,13 0,25
3 S 200 --- 800 3,0 0,27 0,5
4 S 300 --- 700 3,0 0,3 0,755 S 400 --- 600 3,0 0,27 1
6 S 500 --- 500 3,0 0,45 1,25
7 MP --- 1,0 0,0 3,0 0,3

Tabla nº1
Abs concentración
0,13 0,25
0,27 0,5
0,3 0,75
0,27 1
0,45 1,25
Se sacan los puntos (0,5;0,27)(1;0,27)
Tabla nº2
Abs Concentración
0,13 0,25
0,3 0,75
0,45 1,25








Cálculos y resultados:
Concentración tabla principal:
Ecuación 1
C1 * V1 = C2 *V2


2.- 10mg* 0.1ml = X mg* 4ml
1mg/ml=X
4 ml
x= 0.25 mg

3.- 10 mg * 0.2 ml= X mg* 4ml
2mg/ml=X
4ml
X= 0.5 mg

4.- 10 mg * 0.3 ml= X mg* 4ml
3mg/ml= X
4ml
X=0.75 mg

5.- 10 mg * 0.4 ml= Xmg * 4ml
4 mg/ml=X
4ml
X= 1 mg

6.- 10mg * 0.5 ml= X mg * 4ml
5 mg/ml=X
4 ml
X=1.25 mg
















Muestra problema (grafico n°2):
Y =...