Cuantificación proteínas

GRADO EN BIOTECNOLOGÍA PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA: BIOMOLÉCULAS
Yolanda Aguilera García yagugar@upo.es Tutoría: Jueves de 15 a 16h y de 19 a 20h Despacho: Edificio 22, 3ª planta

EVALUACIÓN DE PRÁCTICAS

La nota de prácticas supone un 36% de la nota final que se repartirá: • • • • 15% Asistencia 15% Informe de prácticas 35% Examen de practicas semanal que será teórico 35% Examen final dedestreza que será práctico

PRÁCTICA 1: RECONOCIMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVOS: •Observar el efecto de diversos agentes sobre una solución proteica •Conocer las diferentes reacciones colorimétricas para identificar proteínas •Conocer los diferentes métodos de cuantificación de proteínas.

COAGULACIÓN DE PROTEÍNAS

AGENTES DESNATURALIZANTES: •TEMPERATURA •COMPUESTOS POLARES•pH •SALES

DESNATURALIZACION: Solubilidad y fuerza iónica

DESNATURALIZACION
PROTOCOLO: TUBO MUESTRA: 4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA 1
TUBO 1
1ml de Acetona/ Metanol

TUBO 2
1ml de HCl/ NaOH 40%

TUBO 3
1ml de ClNa 20%

TUBO 4
Temperatura 100º

RESULTADOS:
TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4 Agente Agente Agente Agente

REACCIÓN DE BIURET
OBJETIVO: Es un método que detecta lapresencia de compuestos con dos o más enlaces peptídicos y, por tanto, sirve para todas las proteínas y péptidos cortos.

H N H2N C O C NH2 O

-

O

H C NH

O

H HN C

O NH O

HN C NH
-

Cu++ O

HN C H

O

H

Biuret Complejo cúprico coloreado

REACCIÓN DE BIURET
PROTOCOLO: 1. TUBO MUESTRA:
TUBO 1

4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA
TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4

1mlMuestra 1 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%

1ml Muestra 2 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%

1ml Muestra 3 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%

1ml Muestra 4 + 1 ml Reactivo de Biuret + 1ml NaOH 20%

MEZCLAR Y OBSERVAR RESULTADOS

REACCIÓN DE BIURET
RESULTADOS:

TUBO 1 : BIURET ( + ) , TUBO 2 : BIURET ( ± ) , TUBO 3 : BIURET ( + ) , TUBO 4 : BIURET ( --) ,

SI SISI NO

HAY PROTEÍNAS HAY PROTEÍNAS HAY PROTEÍNAS HAY PROTEÍNAS

REACCIÓN DE NINHIDRINA
OBJETIVO: Es un método que nos permite detectar y cuantificar aminoácidos libres.
O CH3 OH O + NH3 OH OH O OH H O + NH3 + CO2 +

CH3 OH H

O

NINHIDRINA

ALANINA

O HO HO OH + NH3 + H O HIDRIDANTINA

O N O

NINHIDRINA

COMPUESTO COLOREADO

-O

O + 3 H2O

O

O

REACCIÓN DENINHIDRINA
PROTOCOLO: 1. TUBO MUESTRA:
TUBO 1

4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA
TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4

1ml Muestra 1 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina

1ml Muestra 2 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina

1ml Muestra 3 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina

1ml Muestra 4 + 0.5 ml de reactivo de ninhidrina

MEZCLAR E INCUBAR 1 MINUTO A 100ºC

REACCIÓN DE NINHIDRINA
RESULTADOS:Ninhidrina (-)

Ninhidrina (+)

TUBO 1 : NINHIDRINA ( - ) , TUBO 2 : NINHIDRINA ( - ) , TUBO 3 : NINHIDRINA ( - ) , TUBO 4 : NINHIDRINA (+ ) ,

NO NO NO SI

HAY AMINOÁCIDOS LIBRES HAY AMINOÁCIDOS LIBRES HAY AMINOÁCIDOS LIBRES HAY AMINOÁCIDOS LIBRES

CONCLUSIONES FINALES

MUESTRA 1 : BIURET (+) y NINHIDRINA (-) MUESTRA 2 : BIURET (+) y NINHIDRINA (-) MUESTRA 3 : BIURET (+) y NINHIDRINA (-)MUESTRA 4 : BIURET (-) y NINHIDRINA (+)

TIENE PROTEÍNAS TIENE PROTEÍNAS TIENE PROTEÍNAS NO TIENE PROTEÍNAS, TIENE AMINOÁCIDIOS

REACCIÓN XANTOPROTEICA
OBJETIVO: Es un método que nos permite detectar aminoácidos con grupos fenilo (tirosina, triptofano y fenilalanina)
COOH C NH+3 CH2

H2O

R NO2 NO2

+ 2 HNO3

R NO2

+
NO2 AMARILLO

NaOH

R NO2Na NO2Na

+ CO2

ANARANJADOREACCIÓN XANTOPROTEICA
PROTOCOLO: 1. TUBO MUESTRA:
TUBO 1

4 tubos de ensayo con 1ml de MUESTRA
TUBO 2 TUBO 3 TUBO 4

1ml Muestra 1 + 1 ml de HNO3 concentrado

1ml Muestra 2 + 1 ml de HNO3 concentrado

1ml Muestra 3 + 1 ml de HNO3 concentrado

1ml Muestra 4 + 1 ml de HNO3 concentrado

MEZCLAR E INCUBAR 5 MINUTOS A 100ºC

Colocar en hielo y agregar 3ml de NaOH 40%

REACCIÓN...