Cuantificacion De Adn

La cuantificación exacta de la cantidad de ADN es importante; mediciones fluorométricas suelen ser más precisos que los espectrofotométrica a bajas concentraciones.
La concentración de todos los ADN se debe ajustar a 5, y deben ser alícuotas en cantidades apropiadas y se congelaron hasta que se necesite.
Tome nota del número de lote de la enzima Taq disponible y realizar las experiementsnecesarias para determinar las cantidades óptimas de enzima y de MgCl2 para un mejor rendimiento. Repita estas pruebas cada vez que se cambia a un nuevo lote de enzima.
utilizar filtrados puntas de pipeta para la preparación de todas las existencias de reactivos incluidos en estos protocolos, así como para pipetear los ADN y cebadores.
Para asegurar resultados consistentes y repetibilidad, serecomienda encarecidamente que todos los que trabajan que todas las soluciones de trabajo (cebadores, tampones, nucleótidos) se preparó de antemano para todos los experimentos planificados utilizando los mismos reactivos y de alta calidad. Con esta estrategia, las alícuotas de las poblaciones de trabajo se pueden preparar para cada experimento y se almacena congelado (-20 ° C); luego éstos sedescongelaron sólo una vez, en el día de un experimento particular.
1 -. Preparar una mezcla de reacción que contiene todos los componentes que se enumeran a continuación, excepto el ADN y el primer decámero.
2.-mix alícuota mayor en cada tubo rotulado.
3.-Añadir cebador y la muestra de ADN a cada tubo. Brevemente Mix (opcional: centrifugue).
4.-Cubra cada muestra con 2 gotas o 50 de aceite mineralultrapuro.
5 -. Coloque en la máquina PCR, asegurándose de que haya aceite en cada pozo sufficiente para proporcionar buen contacto con el tubo.
6 -. Amplifique con el siguiente programa.
. 7 - Opcional: Elimine el aceite mediante la adición de 25 TE y 50 del cloroformo. Mezcle y centrifugue. Pipetear capa acuosa superior a un tubo nuevo.
8 -. Añadir 5 de 5X SGB a cada tubo. Mezclar bien ycentrifugue brevemente.
9 -. De carga 12 de cada muestra en un gel de agarosa al 2% preparada con TBE 1X tampón de gel (THS da resolución igual a nuevos tipos de agarosa) -
10 -. Electroforesis a 35-40 mA, corriente constante, con recirculación de búfer hasta que el colorante azul ha migrado según sea necesario (aproximadamente 3 horas de 20x25 cm geles de baño).
11 -. Gel Stain en 1 con bromuro deetidio.
12 -. Enjuague el gel en h20 durante 30 min, deslice el gel en un transiluminador UV y photopraph.
Para Fotodyne PCM-10 Cámara con capucha 20x26 cm y Tipo 667 utilización película Polaroid y f8, una segunda exposición.

Criopreservantes
Podemos distinguir dos tipos: agentes penetrantes y agentes no penetrantes.
Agentes penetrantes Son compuestos de bajo peso molecular y permeables através de la membrana. Actuan desplazando el agua del interior de la célula evitando así la formación de cristales de hielo intercelulares los cuales actúan como cuchillos. Estos criopreservantes se utilizan en congelaciones a velocidad muy lenta y los más comunes son:
* Dimetil sulfóxido (DMSO): Es muy tóxico a temperatura ambiente, pero si se aplica a baja temperatura es el que posee mejorresultado.
* Glicerol: Muy utilizado para mantener enzimas entre los -5 a 4 ºC sin congelar.
* Etilenglicol
* 1,2 propanodiol (PROH)
Agentes no penetrantes Son compuestos de elevado peso molecular que no son permeables a través de la membrana sino que actúan fuera de la célula promoviendo una rápida deshidratación de la misma. Se utilizan en congelaciones a velocidades muy altas y los másconocidos son:
* Polivinil pirrolidona (PVP): La PVP no tiene un movimiento rápido tisular (a través de lostejidos), por lo que se utiliza mucho en embriones.
* Lipoproteínas de la yema de huevo
* Proteínas de elevado peso molecular
* Polietilenglicol (PEG)
Además se ha observado que la glucosa, la trealosa y otros glúcidos pueden actuar como criopreservantes naturales.1...