Cuantificacion De Hemoglobina

Practica No.6
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA
OBJETIVO:
El alumno determinara la concentración de hemoglobina (Hb) por el método de cianometahemoglobina en una muestra de sangre.
INTRODUCCION:
Para determinar la hemoglobina, los eritrocitos son lisados y su contenido es liberado. La densidad óptica de la solución en espectofotrometo, es directamente proporcional a la concentración de lahemoglobina, esta se mide en gramos por decilitros (g/dl) y representa la cantidad de esta proteína por unidad de volumen. Este parámetro se emplea para definir si hay o no anemia. Las cifras normales o de referencia de la hemoglobina son variables y dependen de la edad, sexo, altura de residencia, etc. A la altura de la ciudad de México 2240 metros sobre el nivel del mar las cifras inferiores normalesde hemoglobina en adultos son de 12 g/dl para mujeres, de 15.5 g/dl para varones. Las cuantificaciones de Hb inferiores a las mencionadas permiten establecer el diagnostico de eritrocitosis en la ciudad de México. El término de policitemia debe reservarse para situaciones en las que además de eritrocitosis hay leucocitosis o trombocitosis; por lo tanto el término de policitemia secundaria ahipoxemia crónica es incorrecto y debe sustituirse por eritrocitosis secundaria a hipoxemia crónica.
La HB se mide por medio de citometros de flujo y es necesario establecer los valores de referencia, tomando en cuenta las variables antes mencionadas. Es importante tomar en cuenta la variación diurna en los valores de la HB, Hematocrito y recuento eritrocitario, con valores más altos en la mañana y másbajos al atardecer. Hay también variaciones como resultado de las técnicas de extracción de sangre los valores de la Hb. Son 0.7g/100ml mayores si se obtiene la muestra con un individuo puesto de pie en lugar de estar acostado boca arriba. Una vasoconcentración de la muestra y Hb elevada.
FUNDAMENTO:
La sangre se hemoliza por agregado de un agente tensoactivo con ferrocianuro de potasio queoxida al átomo de Fe++ a Fe+++ para producir metahemoglobina. El KCN estabiliza la metahemoglobina como cianometahemoglobina. La coloración producida es directamente proporcional a la concentración de Hb presente.

TUBO | DRABKIN| ESTANDAR| Conc. g/dl.| LECTURA|
BLANCO| 5 ml . | 0 ml. | | |
1 | 4 ml. | 1 ml. | | |
2 | 3 ml. | 2 ml. | | |
3| 2 ml. | 3 ml. | | |
4 | 1 ml. | 4 ml. | | |
5 | 0 ml. | 5 ml. | | |

CÁLCULOS:
g/dl = ml del estándar x Conc. del estándar (gdl) / ml totales x 251
Para saber la dilución en la que se está trabajando se hace lo siguiente:
Son 5ml de sol. de Drabkin y 0.02 de sangre, si se suman resulta 5.02 ml, luego se divide entre 0.02 (5.02/0.02=251), 251 esla dilución.

PARA HACER LA LECTURA:
Con un filtro de 540nm. Se coloca la celda que solo contiene el reactivo blanco ( 5ml. Drabkin ) y el aparato se sujeta a cero de absorción (100% de transmisión). El contenido de los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 se transfieren a celdas limpias, secas y seleccionadas.
La cara externa de las celdas debe limpiarse cuidadosamente, para quitarles huellas digitales ypelusas. Las celdas de colocan sucesivamente dentro del aparato y se registran las lecturas de cada una. Si las lecturas se hacen en absorción, se indican en la escala vertical y la concentración de Hb en la escala horizontal del papel milmétrico. Los valores de Hb de las muestras problemas de sangre que se diluyen de manera semejante, pueden obtenerse en esta grafica de calibración.
Otra manerade dar el resultado de una muestra problema es sumando las lecturas de los tubos de las diluciones para la preparación de la gráfica y sacar la media, el resultado será el factor por el que debe multiplicarse la lectura de la muestra problema, dando así la concentración de la hemoglobina de la muestra problema.

VALORES DE REFERENCIA:
Hombres……………………………. 16 g/dl (límites de 14.5 – 17.5 g/dl)...