Cuantificacion de la b galactosidasa

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UNIVERSIDAD TECNOLOGICA METROPOLITANA
Facultad de Ciencias Naturales, Matemáticas y Medio Ambiente
Departamento de Biotecnología

Ingeniería en Química

2180

Laboratorio Nº 3

“Cuantificación de la actividad de
β-galactosidasa”

INTRODUCCIÓN

Las enzimas corresponden a un tipo especial de proteínas, son de tipo globular y tienen actividad catalítica. Las enzimas sonaltamente específicas en cuanto a su función, catalizando cada reacción en condiciones especificas de temperatura y pH, para cada enzima.
Para conocer la concentración de una enzima especifica, se determina mediante su actividad, la cual corresponde a la cantidad que cataliza la formación de 1µmol de producto por minuto en condiciones experimentales definidas.
Al aislar o purificar una enzima, sedebe determinar la cantidad de enzima presente en las distintas etapas del fraccionamiento, y debido a que durante la purificación de una enzima se involucra la remoción selectiva de otras proteínas, es necesario establecer la cantidad de actividad enzimática presente en cada etapa del proceso de purificación.
Para ello utilizamos la actividad específica de una enzima, la cual corresponde a unamedida de la actividad enzimática por miligramo de proteína.
Los ensayos de actividad enzimática se realizan en condiciones de pH óptimo y en donde la concentración del sustrato esta por encima del nivel de saturación, de este modo la reacción es de orden cero respecto al sustrato. De este modo se tiene que la velocidad inicial de la reacción es proporcional a la concentración de enzima.
En estepráctico se estudiara la actividad de la enzima β-galactosidasa. Esta también es conocida como lactasa se encuentra en el intestino de mamíferos y en ciertos microorganismos. Su sustrato natural es la lactosa, la cual es hidrolizada por esta enzima y en condiciones especiales son capaces de cambiar la glucosa de este azúcar por otro grupo aglicón presente en el medio (transgalactosidación).
Laβ-galactosidasa es muy utilizada en la industria alimenticia para producir productos para el consumo de personas intolerantes a la lactosa.

Objetivos

• Medir la velocidad de una reacción enzimática
• Determinar la actividad especifica de una enzima
• Observar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de reacción catalizada por la β-galactosidasa

Materiales• Buffer 2X: Na2HPO4 30mM, NaH2PO4 20mM, KCl 10mM, pH 7.5
• ONPG 3 mg/ml
• Preparacion de β-galactosidasa

Diagrama de Flujo

Procedimiento y Resultados

Para medir la actividad de una enzima, se mide la concentración de producto en el tiempo. Un método consiste en medir la absorbancia del producto en un espectrofotómetro, pero antes se debe encontrar una relación entreestos dos parámetros. Una forma de hacerlo es elaborar experimentalmente una curva de calibración utilizando soluciones de concentración conocida, en este caso el o-nitrofenol.

Curva de calibración de o-nitrofenol

Se preparan las 7 soluciones a diferentes concentraciones de o-nitrofenol de concentración 2mM con un volumen final de 5ml, y el blanco.
Se calibra el espectrofotómetro con el blancoy se mide la absorbancia de cada tubo, dejando los resultados registrados en la siguiente tabla.

|[ONP] µM |Vol. Sol. 2mM |Buffer 2x |Agua Destilada |Absorbancia |
|50 |0.125 |2.5 |2.375 |0.140 |
|75|0.188 |2.5 |2.312 |0.210 |
|100 |0.25 |2.5 |2.25 |0.290 |
|200 |0.5 |2.5 |2 |0.556...