Cuantificacion de preteinas

Cuantificación de proteínas totales
Técnicas tales como SILAC, iTRAQ, ICAT, y AQUA están disponibles para la cuantificación de proteínas y péptidos por espectrometría de masas. All of the techniques include some form of stable isotope (eg carbon-13) incorporation into proteins that is detected by the mass spectrometer and used for quantification. Todas las técnicas incluyen algún tipo deisótopos estables (por ejemplo, carbono-13) la incorporación en las proteínas que es detectado por el espectrómetro de masas y se utiliza para la cuantificación. Each quantification technique has its own strengths, limitations and requirements. Cada técnica de cuantificación tiene sus propias fortalezas, limitaciones y necesidades.
Los medios actuales para la cuantificación de proteínas están basados engel o en MS. El estándar preferido para la proteómica-2DE es la cuantificación por electroforesis diferencial en gel (DIGE, por sus siglas en inglés) con teñido diferencial de las proteínas separadas y análisis de imagen. Alternativamente a DIGE y compatible con la cromatografía líquida en línea (LC)-MS/MS, isótopos estables pueden ser introducidos en las condiciones en cuestión.
Estas técnicasde etiquetado pueden ejecutarse a nivel proteína (ej. AniBAL [marcado por anilina y ácido benzoico]) o péptido (ej. ICAT [etiqueta por afinidad codificada por isótopo], iTRAQ [etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta] o TMT [etiqueta por masa tándem]) y pueden ser introducidas químicamente en una muestra (ICAT, iTRAQ, TMT o AniBAL) o metabólicamente alimentando células o aúnpequeños animales (ej. Ratones y ratas) con amino ácidos etiquetados isotópicamente estables en cultivo celular (SILAC). La lectura de cuantificación puede ser obtenida a nivel MS-ICAT, SILAC y AniBAL) o MS/MS (iTRAQ y TMT).
Los principales métodos empleados para la determinación de proteínas totales son los siguientes:

Método del Biuret
Las proteínas son muy abundantes en sustanciasorgánicas, pero son generalmente incoloras y por lo tanto difícil de cuantificar. The Biuret reagent solves this difficulty because the copper sulfate in that reagent reacts with peptide bonds, producing a violet color in an aqueous mixture. El reactivo de Biuret resuelve esta dificultad porque el sulfato de cobre en ese reactivo reacciona con los enlaces peptídicos, produciendo un color violeta en unamezcla acuosa
El color violeta indica la presencia de la proteína. Single amino acids and dipeptides do not give the Biuret reaction, but tripeptides and larger polypeptides or proteins will react to produce the violet complex. Solo aminoácidos y dipéptidos no dan la reacción de Biuret, pero tripéptidos y más grandes polipéptidos o proteínas reaccionan para producir el complejo de color violeta. Onecupric ion forms a colored coordination complex with four to six nearby peptides bonds. Un ion cúprico forma un complejo de coordinación de color con cuatro a seis enlaces péptidos cerca. The intensity of the color produced is proportional to the number of peptide bonds participating in the reaction. La intensidad del color producido es proporcional al número de enlaces peptídicos participan enla reacción. If a small food sample is ground up and suspended in water, and Biuret reagent is added to the suspension, the blue reagent will turn purple or violet within about 15 minutes if the food sample contains protein. Si una muestra de alimentos en pequeña es cero y la suspensión en el agua, y el reactivo de Biuret se añade a la suspensión, el reactivo azul se volverá de color púrpura ovioleta en 15 minutos si la muestra de los alimentos contienen proteínas. If the food sample does not contain protein, the reagent will remain blue (an example of a qualitative test). Si la muestra de alimento no contiene proteínas, los reactivos son azules. The deeper the color, the greater the concentration of protein. Cuanto más profundo el color, mayor es la concentración de proteína. (Here...