cuantificacion de proteinas bradford

OBJETIVOS

Determinar la concentración de proteínas de una muestra desconocida a partir de una curva de calibración de albúmina, usando el método de Bradford.








































MARCO TEÓRICO

Analizamos aquí los métodos más importantes para la cuantificación de proteínas y sus respectivas ventajas y desventajas:

Método deBradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el mismo está basado en el cambio de color del colorante Coomasie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. Este compuesto interacciona con aminoácidos básicos (especialmente arginina) y aromáticos. Esta unión del colorante con las proteínas provoca un cambio en el máximo de absorción del colorante desde 465 a595 nm. Por lo tanto, este método se basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la proteína. Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465 nm).

Ventajas del método de Bradford:

Método rápido (la reacción sepuede completar en 2 minutos).
Reproducible.
Sensible (mucho más que el método de Lowry).
No existe interferencia de cationes como K+, Na+, y Mg+.
No existe interferencia del sulfato de amonio.
No existe interferencia de los polifenoles ni carbohidratos como la sacarosa.
Mide proteína o péptidos con una masa molecular aproximadamente igual o mayor de 4 000 daltons.

Desventajas del método deBradford:

El complejo proteína-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo.
El color varía con diferentes tipos de proteínas.
La proteína estándar debe seleccionarse con mucho cuidado.
Interferencia con detergentes.

Método de Lowry: (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlacespeptídicos de las proteínas y se reduce a Cu+. El Cu+ así como los grupos R de Tirosina, Triptófano y Cisteína reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reacción ocurre en medio ácido.
Aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: ácidos fuertes o buffers), losquelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) serán interferentes de la reacción. Las proteínas producirán distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido de Tyr y Trp.

Ventajas del método de Lowry:

Muy sensible.
Menos afectado por la turbidez de la muestra.
Más específico que la mayoría de los otros métodos.Relativamente simple.
Se puede completar en 1 a 1.5 horas.

Desventajas del método de Lowry:

El color varía con diferentes proteínas (más que el método de Biuret).
El color no es estrictamente proporcional a la concentración de proteínas.
La sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la reacción.
Las altas concentraciones de azúcares reductores,sulfato de amonio y compuestos con sulfhidrilo interfieren con la reacción.

Método de Biuret: El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que se puede observar a 310 nm o 540-560 nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatroátomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es...