Cuantificacion De Proteinas Por Metodo De Biuret

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Práctica 7
“Cuantificación de Proteína por método de Biuret”



INTRODUCCIÓN
Las proteínas ocupan un lugar de máxima importancia entre las moléculas constituyentes de los seres vivos (biomoléculas). Prácticamente todos los procesos biológicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de moléculas (Berg et al, 2008).
Determinar laconcentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta, cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el diagnóstico de enfermedades, así como para muchos otros propósitos. Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basanen: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes (Segal, 2005).

La reacción de biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de un enlace peptídico, como lasproteínas (Cambell et al, 2006):

La curva de patrón es un método de química analítica empleado para medir la concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar(la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una función matemática que relacione ambas; después, se lee el mismo carácter en la muestra problema y, mediante la sustitución de la variable independiente de esa función, se obtiene la concentración de esta. Se dice pues que la respuesta de lamuestra puede cuantificarse y, empleando la curva patrón, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentración (Harris, 2003)

OBJETIVO GENERAL
Fue aplicado un método colorimétrico para determinar la concentración de proteína en una muestra problema.
OBJETIVOS PARTICULARES
* Aprendimos el manejo del espectrofotómetro y su aplicación en los métodoscolorimétricos.
* Se aprendió el empleo de una curva patrón para la determinación de la cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de proteínas.
* Fue determinada la concentración de proteínas en una muestra de leche, utilizando el método de Biuret.
HIPÓTESIS
Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada con el reactivo de Biuret ésta será proporcional a laconcentración de proteína de dicha muestra.

MATERIAL
* 2 vasos de p.p. de 500 ml
* 24 tubos de ensayo
* 1 probeta de 10 ml
* 1 pipeta graduada de 10 ml
* 2 pipetas graduadas de 5 ml
* 4 pipetas graduadas de 1 ml
* 1 motero con pistilo
* 1 gradilla
* 3 vasos p.p. de 50 ml
* 1 matraz aforado de 100 ml
* 1 matraz aforado de 50 ml
* 1 termómetro
* 1espectrofotómetro
* 2 celdas
* 1 piceta
* 1 propipeta
* 1 parrilla de calentamiento con agitador magnético
* 1 baño maría
REACTIVOS
* NaOH
* NaCl
* Albúmina sérica (BSA)
* Reactivo de Biuret

METODOLOGÍA
Primero, se dispuso a tomar la caseína y macerar con ayuda de un mortero con pistilo, después se peso para ocupar 0.1g para una solución de 1:10, al nodisolverse bien se le agregaron gotas de hidróxido de sodio hasta llegar a la homogenización deseada, también se realizo la solución de leche 0.05ml para una solución 1:20 y se disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua hasta llegar a una temperatura de 500C a 550C.
A continuación, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12 “A y B” los seis primeros se utilizaron para obtener...