Cuantificacion De Proteinas

“LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I”


Informe Nº1 Cuantificación de Proteínas















































INTRODUCCIÓN

Las proteínas se caracterizan por ser los componentes más abundantes en las células, debido a que están involucradas en procesos tales como el transporte de moléculas hasta la catálisis de reacciones que sucedenen seres vivos (enzimas) (1). Dentro de la cuantificación de proteínas existen diferentes métodos que se basan en su mayoría en las propiedades intrínsecas de las proteínas para absorber la luz en el espectro ultravioleta UV (todas las proteínas pueden absorber luz en el UV lejano debido al enlace peptídico, y absorber luz en el UV cercano sólo si tienen residuos aromáticos), la formación dederivados químicos, o la capacidad que tienen éstas de unirse a ciertos colorantes (2). Algunos métodos empleados son los siguientes:
• Método de Biuret: este método se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu+2 y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. Un Cu+2 se acompleja con cuatro NH. La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad deproteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja (1-10[mg]) y sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados. Se mide la absorbancia de la solución a 540[nm] (3)(4).
• Método de Bradford: se basa en la unión de un colorante, el azul de Coomasie G-250 a lasproteínas. El colorante en solución ácida, existe en dos formas, una azul y otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante. Este método es más sensible que el anterior (5-30[µg]) y pocas sustancias interfieren en su determinación. Algunas de esas sustancias que interfieren son los detergentes y las soluciones básicas. Se mide la absorbancia a 595[nm](3)(5).
• Medición Espectrofotométrica: de forma intrínseca, los aminoácidos aromáticos como el triptófano, fenilalanina y tirosina absorben en un rango del espectro desde 270 a 280[nm] de luz. Esto es por los electrones que forman los anillos aromáticos, los que están en constante resonancia, van a absorber la energía electromagnética. El problema de este método es que debido a que sólo se basa dela presencia de aminoácidos aromáticos, va a variar los resultados entre proteínas diferentes (4).

La medición espectrométrica que se utiliza en estos métodos tiene sus fundamentos en la ley de Lambert-Beer, la que relaciona la absorción de la luz con la concentración de las soluciones (6). Esta ley es la siguiente:
A = (·b·c

Donde A es absorbancia, ( es coeficiente de extinción molar, en[cm-1M-1], b es el camino óptico en [cm], el cual se refiere al ancho de la cubeta donde se encuentra la solución y c es la concentración en [M]. Es importante mencionar que los valores de concentraciones pueden estar en unidades proporcionales a M como µ, mg, etc.








OBJETIVO


1) Comprender la base de los métodos de Biuret y Bradford para la determinación de proteínas.2) Aplicar el método de Biuret y Bradford para cuantificar las concentraciones de
Una muestra desconocida.
2) Determinar la concentración de proteínas presentes en una muestra problema, a través de la construcción de una curva de calibración.

4) Comparar los resultados obtenidos con ambos métodos y determinar su
exactitud.


METODOLOGIA

PARTE I: se compone dedos partes. La parte A consiste en la curva de calibración del método de Biuret y la parte B es la determinación de la concentración de proteína en una muestra problema utilizando el mismo método.

A. Curva de calibración del reactivo de Biuret:
En seis tubos de ensayos, rotulados del número 1 al 5, siendo el sexto tubo correspondiente al blanco, rotulado como B, se procedió a realizar las...