Cuantificacion De Proteinas

Métodos de cuantificación de proteínas |
Métodos espectrofotométricos |

Métodos espectrofotométricos de cuantificación de proteínas

Existen diversos métodos para la cuantificación de las proteínas, todos ellos basados en alguna de sus propiedades típicas, como pueden ser los patrones de absorción de las radiaciones electromagnéticas. (Badui S., 1999).
La elección del método que debeutilizarse para la cuantificación de las proteínas de una muestra, depende básicamente de seis puntos principales (Fiorentino S., 1994):
1. La cantidad de proteína disponible para el ensayo.
2. Su concentración.
3. La especificidad de la técnica.
4. La presencia de sustancias químicas que pueden interferir en el ensayo.
5. La disponibilidad de los reactivos para su realización.6. Su sensibilidad.
A continuación se presentan los métodos espectrofotométricos para la cuantificación de proteínas.
Métodos basados en la absorción ultravioleta
El método se basa en que las proteínas absorben luz en la región UV con dos máximos: a 280nm (menor energía) y 200nm (mayor energía), según el tipo de electrones que puedan ser excitados, los electrones que absorben menos energía(a 280nm), son los ubicados en los anillos aromáticos de la fenilalanina, triptófano, histidina y tirosina, la proteína con un bajo contenido de aminoácidos aromáticos presentará una menor absorbancia. Tanto la estructura secundaria como la terciaria, pueden influir en el espectro de absorbancia de la proteína. Es por esto que factores como el pH del buffer, polaridad y fuerza iónica puedenalterar la absorción de la luz. (Fiorentino S., 1994).
Las uniones peptídicas absorben fotones a 210nm debido al alto número de uniones presentes en una proteína. Este es un rango particularmente sensible, pero presenta la desventaja de que algunos químicos que contienen dobles enlaces entre carbonos o entre carbono y oxígeno, pueden presentar interferencias. (Badui S., 1999).
Fundamento: presenciade grupos cromóforos de tirosina, fenilalanina y triptófano. Si se considera que la cantidad de estos aminoácidos es siempre constante, la absorbancia debe ser proporcional a la concentración de proteína.
Ventajas: es el método más rápido, requiere de muy poca cantidad de proteína. El sulfato de amonio no interfiere, mientras que en la mayoría de los métodos si existe interferencia. La muestra nose destruye y puede ser usada en otros análisis. Sencillez experimental.
Desventajas: existen diversos componentes biológicos que absroben a esta longitud, como los ácidos nucleicos. Varía según la cantidad de compuestos aromáticos en la proteína.
Longitud de onda: 220nm.
Aplicaciones: sus aplicaciones se reducen a procedimientos muy reproducidos y muy repetidos en un laboratorio y solamentecon proteínas puras. (Badui S., 1999).

Ensayos colorimétricos
Son los más utilizados, pero tienen la desventaja de tener que utilizar la misma proteína como patrón para obtener valores reales; estos se deben ensayar en las mismas soluciones y al mismo tiempo que las muestras desconocidas para descartar variables tales como las interacciones de los reactivos con el buffer, la descomposición delos reactivos, las diferencias de tiempo y los cambios de temperatura. (Fiorentino S., 1994)
a) Métodos colorimétricos de alta sensibilidad
Método de Bradford
Muchas de las proteínas son capaces de fijar colorantes en la superficie. La fijación del colorante va acompañada muchas veces por un cambio en las propiedades espectroscópicas del mismo, con el consiguiente cambio de color que dala formación del complejo frente al del colorante no unido a la proteína. (Battaner E., 2000).
El método de Bradford también se conoce como azul de Coomasie; el colorante azul de Coomasie después de haberse unido a la proteína en una solución ácida de shift (ácido fosfórico en etanol), desarrolla una absorbancia máxima de 465 a 595nm, lo cual se debe a que la proteína establece uniones...