Cuantificacion de Proteínas

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIA GUANAJUATO



LABORATORIO DE BIOQUIMICA FARMACEUTICA


PRACTICA 2
Cuantificación de Proteínas


EQUIPO 2
Jorge de Jesús Mendoza Gutiérrez
Oscar Efraín Fernández Delgado
Diego Armando Medina Pérez












OBJETIVOS:

1. Aprender sobre la cuantificación de proteínas vía un método colorímetro, para elucidar conprecisión su curva de calibración.
Introducción
Toda compuesto perteneciente a la naturaleza posee una función determinada, tanto física, como química y biológica; demostrándonos como puede intervenir la misma en diversos procesos fisiológicos a nivel naturaleza. Pero no resulta suficiente solo conocer esta información, también necesitamos tomar en cuenta un modelo matemático y estadístico paraelucidar a mayor precisión el grado a intervenir de dicho compuesto, en este caso las proteínas, en todo proceso fisiológico; para ello resultara menester conocer cuantitativamente la concentración de las proteínas vía métodos basados en la formación de complejos coloridos entre las proteínas y sus reactivos. [2][3]
Métodos para cuantificar la concentración de Proteínas
Método de Bradford.-este método es muy usual y factible debido a su compatibilidad con los agentes reductores y la rapidez con la que se determina dicha concentración; mostrando resultados rápidos. [1][4]
Reacción de Biuret.- utilizado por su sencillez y economía, pues solo requiere una solución alcalina Cu para formar un complejo azul purpura con los enlaces peptídicos de la proteína. [2][3]
Método del BCAAbsorción Ultravioleta.- utilizado comúnmente para muestras pequeñas y valiosas debido a la alta sensibilidad [4]
Método de Lowry.- mayormente utilizado debido a la facilidad con a que se pueden cuantificar proteínas de membrana, gracias a que presenta un color estable y preciso de la concentración en la proteína. [2]
Para la elaboración de nuestro trabajo experimental nos basaremos principalmente en elMétodo de Lowry
Método de Lowry
Sensible, capaz de detectar cantidades de orden 10 microgramos de proteína y color estable que reconoce la concentración, aunque pueden variar los colores entre distintas proteínas, utilizando Cu o un reactivo Folin sin digestión previa. Se identifica de los demás métodos debido a que el color no es proporcional a la concentración y es fácil de acoplar a análisiscon pequeña escala. [1][2][3][4]
Desarrollo
Para desarrollar exitosamente el color en las proteínas se lleva acabo lo siguiente:

Reacción con Cu en medio alcalino. [1][2]
Reducción del reactivo fosfomolíbdico-fosfotungstico por complejo proteína-cobre. [1][2]

Elucidaciones

En ausencia de Cu, el color natural de las proteínas se atribuye a su contenido de tirosina y triptófano. [1][2]
Enmedio alcalino, la presencia de cobre auxilia en el desarrollo del color vía incremento (3 a 15 veces). [1][2]
El cambio en la absorbancia producido por la reducción del reactivo Folin es monitoreado a 750 nm (García y Vázquez-Duhalt, 1998). [1][2]

Reactivos y Material
Reactivos
Material (por grupo)
Solución patrón de albumina (5.0 mg/mL)
15 tubos de ensaye
Solución problema 1 (traer un huevo porgrupo)
2 Gradillas para tubos
Solución problema 2
1 pipeta de 5 mL

1 micropipeta de 1 mL

1 micropipeta de 0.2 mL

Agua destilada

Etanol 96

1 vaso de precipitado de 250 mL

Celdas para espectrofotómetro

1 Piseta para agua

1 Piseta para etanol

Marcador

Resultados y Observaciones
Tabla.1. Soluciones patrón de albumina de huevo
Tubo
Concentración
(mg/ml)
Vol. Sol. Starck albumina
5mg/mlVolumen de H2O (ml)
Volumen final
1
0.0
0.0
0.40
0.4
2
1.25
0.08
0.32
0.4
3
2
0.16
0.24
0.4
4
3
0.24
0.16
0.4
5
4
0.32
0.08
0.4
6
6
0.40
0.0
0.4

Tabla 2. Disoluciones para curva estándar
Muestra
1
2
3
4
5
6
Muestra
(proteína) (ml)

--

0.4

0.4

0.4

0.4

O.4
Agua destilada
(ml)

O.4


--

--

--

--

--
Reactivo C(ml)
2
2
2
2
2
2
Mezclas a incubar a temperatura ambiente por 30 min
Reactivo...