Cuantificación de proteínas por espectroscopia de absorción método de bradford

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA METROPOLITANA
Departamento de Biotecnología

Laboratorio de Bioquímica

Cuantificación de proteínas por espectroscopia de absorción Método de Bradford

Introducción
Los métodos espectroscópicos permiten estudiar la estructura tridimensional de moléculas biológicas y los cambios conformacionales que ellas experimentan
Por otra parte, durante losprocedimientos de separación de una muestra y obtención de una proteína pura es a menudo necesario conocer la concentración de proteínas en las sucesivas etapas del proceso. Esto es de particular importancia cuando se está estudiando una proteína con algún tipo de actividad, como por ejemplo las enzimas, para determinar la actividad específica y el rendimiento. La espectrometría de absorciónpermite determinar la concentración de proteínas, ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas en una muestra, gracias a la propiedad de estas de absorber radiación electromagnética.
Existen varios métodos para cuantificar proteínas en una muestra, los que difieren en procedimiento y sensibilidad. El método de Bradford es rápido y muy sensible, utiliza el colorante azul de Coomasie G-250 (azul enmedio neutro) que en un medio ácido adquiere un color café rojizo, pero en presencia de proteínas, el complejo colorante-proteína vuelve a tomar color azul. Este método es útil en el rango de 10 a 800 g de proteínas.
Para poder utilizar este método se requiere realizar una curva de calibración o curva estándar, con soluciones de proteínas de concentración conocida, a las cuales se les mide laabsorbancia en un espectrofotómetro con una longitud de onda de 595 nm. Luego se mide la Absorbancia de la muestra y se intrapola el valor de la concentración en el gráfico Absorbancia vs Concentración de proteínas

Albúminas y globulinas
Tradicionalmente la clasificación de ciertas proteínas -especialmente proteínas de almacenamiento- está basada en sus propiedades de solubilidad:albúminas: proteínas que son solubles en agua o en disoluciones salinas diluidas
globulinas: requieren concentraciones salinas más elevadas para permanecer en solución
prolaminas: solubles en soluciones de etanol/agua (más relevantes en cereales)
Esta antigua clasificación aún tiene validez operativa, especialmente en relación con propiedades técnicas de estas proteínas.

Las proteínas en legumbresconstituyen del 20 % (arvejas) al 40% (soya, lupino) del peso seco de la semilla por lo que las legumbres están entre los alimentos más ricos en proteínas para la alimentación humana. En semillas de legumbres, las globulinas y albúminas son las proteínas más abundantes aunque las primeras están en mayor proporción Sin embargo estas proteínas son deficitarias en aminoácidos azufrados (metionina ycisteina) y triptófano, aunque ricas en el aminoácido lisina, por lo que se complementan muy bien con los cereales que son ricos en metionina y pobres en lisina.
En animales, la albúmina sérica -la proteína más abundante en el plasma- contribuye al transporte de las sustancias hidrofóbicas a través del cuerpo y a regular la presión osmótica de la sangre.
Otras globulinas y albúminas importantesincluyen la ß-lactoglobulina (50%) y α-lactalbumina (25%) -las principales proteínas del suero de la leche- y la ovoalbúmina –principal proteína de la clara del huevo.

Objetivos
* Extraer albúminas de diferentes legumbres
* Aplicar el método de Bradford para determinar la concentración de proteínas de una muestra biológica

Materiales
Solución de proteína (albúmina de suero debovino, BSA) de 1 mg/ml y 0,1 mg/ml
Reactivo de Bradford (azul de Coomasie)
Semillas de diferentes legumbres
Morteros
Solución de extracción (sulfato de potasio 5 %, pH 7)
Espectrofotómetro

Procedimientos

I. Extracción de albúminas de semillas

1. Colocar 3-5 semillas (arveja, garbanzo, haba, lenteja, poroto) en un mortero (2 por mesón y moler hasta obtener una pasta homogénea)....