Cuantificación y análisis de restricción de ADN plasmídico

1. OBJETIVOS

 Aplicar las técnicas de cuantificación de ADN como la espectrofotometría y la electroforesis.

 Comparar los fragmentos de ADN plasmídico obtenidos mediante la aplicación de diferentes enzimas de restricción.

2. INTRODUCCIÓN

Los ácidos nucleicos son las moléculas esenciales para la vida y existe dos tipos de ácidos nucleicos: el ADN y el ARN. Estos estánconformados por tres unidades fundamentales: una base nitrogenada, fosfatos y un azúcar (ribosa (RNA) o desoxirribosa (DNA))1.
Los ácidos nucleicos son extraídos de las células mediante lisis celular, para posteriormente ser cuantificados por métodos de espectrofotometría o por electrolisis2.
Los pasos esenciales para la obtención de ADN son: principalmente la homogenización de la muestra, lafragmentación celular para liberar el ADN (mediante el uso de buffer específicos y cambios físicos del ambiente celular), la eliminación de los componentes que no sean ácidos nucleídos (proteínas, polisacáridos, etc.), por último la extracción del ADN y la precipitación del mismo mediante el agregado de diferentes solventes (ej: etano)3.

Figura 1. Espectrofotómetro TECAN, Equipo deelectroforesis.3
El análisis de la absorción UV de los nucleótidos constituye un método simple y confiable para la determinación de la concentración de ácidos nucleicos y confiable para la determinación de la concentración de ácidos nucleicos en una muestra. Las purinas y las pirimidinas de los ácidos nucleicos muestran una absorción máxima a 260nm; mientras que la lectura a 280nm nos proporciona lacantidad de proteínas en la muestra.
Algo importante para la interpretación de los resultados obtenidos, es tener en cuenta lo siguiente3:
• Una relación entre estos dos parámetros (medidas) cercana a 2 indica mayor pureza del ADN.
• Las absorbancias medidas a 260nm no discriminan entre ADN y ARN; es decir, realizan la lectura para ambos nucleótidos.
• Las absorbancias a 35nm indican partículascontaminantes de las cubetas de lectura.
• Los contaminantes del ADN como lo son los fenoles pueden ser determinados mediante la evaluación del material extraído a absorbancias de 230nm.
• Este método de cuantificación debe de realizarse en espectrofotómetros que tengan filtros para luz ultravioleta.
Para determinar la concentración de ADN, se utiliza la relación:
ADN µg/µl = absorbancia260nm x factor dilución x 50 µg/µl……. (1)
Para determinar la pureza del ADN se establece la relación de:
Pureza ADN = absorbancia 260nm/ absorbancia 280nm……..….. (2)
Para la interpretación de resultados en una cuantificación de ADN, si:
• Una relación entre 1.8-2 indica que la absorción en el rango UV se debe a ácidos nucleicos.
• Una relación menor de 1.8 indica la presencia de proteínas uotros contaminantes.
• Una relación mayor de 2 indica que la muestra puede estar contaminada con cloroformo o fenol3.
La electroforesis en gel de agarosa es un método baste utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN y proteínas. La agarosa es un polímero lineal, extraído de algas marinas, en el cual las moléculas de ADN están cargadas negativamente debido a los gruposfosfato de la molécula, la migración en la cámara de electroforesis ocurre del polo negativo hacia el polo positivo y los factores que afectan a la migración del ADN es el tamaño del fragmentó, la concentración de agarosa, la corriente utilizada y la conformación que presenta el ADN4.
El ADN que se ha extraído de las células se puede digerir con una enzima de restricción, la cual tiene comofunción fragmentar el ADN. Esta enzima reconoce las secuencias especificas en el ADN hidrolizándolo ambas hebras, dando lugar a la formación fracciones de diferente peso molecular, que se separan por electroforesis en geles de agarosa de acuerdo con el tamaño de los fragmentos. Cada banda corresponde a un fragmento de una medida particular, lo cual se determina calibrando el gel con un marcador...